纤维素是自然界中一种重要的可再生资源[1]，占农作物秸秆主要成分的40%~50%[2]。将秸秆中的纤维素降解为可发酵性糖类，之后利用微生物发酵生产饲料，能够缓解我国饲料资源短缺的问题，推动畜牧业的可持续发展。常规处理方法无法彻底降解秸秆中纤维素，且成本高、污染大[3]。而纤维素酶的协同作用可以提高纤维素的分解效率[4]，以高效、环保的方式降解秸秆[5-6]。纤维素酶是一类能够水解纤维素的复合酶系的总称，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶[7]，其主要生产菌株包括链霉菌属（Streptomyces）、曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）等[8-10]。目前，商品纤维素酶价格较高，筛选高产纤维素酶微生物降解纤维素类物质对纤维材料的饲料化[11-13]、肥料化[14-15]、基料化[16-17]、燃料化[18]等具有重要意义。自然筛选的菌株产纤维素酶活力低，分解纤维素能力弱，可采用诱变育种的方式提高菌株分解纤维素能力。紫外诱变是目前常用诱变育种的方式之一。白敏霞等[7]利用紫外诱变筛选获得菌株A4，其FPA酶活为25.30 U/mL，CMC酶活为35.36 U/mL，与出发菌株相比，诱变后的菌株酶活提高了16.00%和26.37%。郑哲等[19]筛选得到一株产纤维素酶细菌，进行紫外诱变后获得的最佳突变株产纤维素酶活力为38.30 U/mL，与出发菌株相比，诱变后的菌株酶活力提高了40.08％。紫外线诱变操作简便，效果显著，适用范围广。本研究从腐烂树木及土壤中筛选得到2株高产纤维素酶菌株，通过紫外诱变进一步选育高产且遗传稳定性良好的菌株，为后续应用于秸秆微生物降解研究提供参考，有利于纤维素类物质的开发与利用。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品样品采自四川轻化工大学宜宾校区后山腐烂树木和腐质土壤。1.1.2培养基富集培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaCl 5.0 g，pH值7.0，蒸馏水1 000 mL。分离培养基[20]：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0 g、(NH4)2SO4 4.0 g、蛋白胨1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 1.0 g、琼脂20.0 g、去离子水1 000 mL。种子培养基[21]：CMC-Na 10.0 g、蛋白胨3.0 g、KH2PO4 4.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、去离子水1 000 mL。PDA培养基：去皮马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g、去离子水1 000 mL。固态产酶培养基：水稻秸秆和麸皮比为3∶1（总固态物料6 g）、料液比1∶2、(NH4)2SO4 0.2 g、KH2PO4 0.3 g。1.1.3试剂3, 5-二硝基水杨酸、羧甲基纤维素钠、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。柠檬酸钠缓冲液（pH值4.8，0.05 mol/L）、水稻秸秆、麸皮、刚果红（1 g/L）。1.1.4仪器设备BM1700生物显微镜购自南京江南永新光学有限公司，DHG-924（0A）电热鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司，UV-1800紫外可见分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司，LRH-300生化培养箱购自常州诺基仪器有限公司，HZ150L型多功能培养摇床购自武汉瑞华仪器设备有限责任公司，DGS-208B＋型手提式压力蒸汽灭菌锅购自江苏登冠医疗器械有限公司，TG-16医用离心机购自四川蜀科仪器有限公司，SW-CJ-2F落地式净化工作台购自上海力辰邦西仪器科技有限公司，PB-10 pH计购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，水浴锅购自天津赛得利斯实验分析仪器制造厂。1.2试验方法1.2.1菌株分离与初筛取10 g土样于锥形瓶中，加入适量灭菌的富集培养基，将锥形瓶置于28 ℃摇床富集培养7 d。富集培养结束后，取上清液1 mL，分别稀释至10-1~10-6，在分离培养基平板上涂布稀释梯度为10-4、10-5、10-6的稀释液，每个稀释梯度设置3个平行平板，将涂布完成的平板于28 ℃培养3 d，选择生长旺盛的菌株进行2~3次分离纯化直至得到单菌落[22]，并对平板进行编号。在分离培养基上用牙签单点接种纯种菌株，在28 ℃条件下培养3 d。培养结束后用刚果红溶液（1 mg/L）进行30 min的染色，使用去离子水缓缓冲洗干净染液，注意尽量不要将菌落冲散。再用NaCl（1 mol/L）溶液脱色30 min，倒掉NaCl溶液，观察是否产生透明圈[23]。若菌落周围产生透明圈，则可初步判断该菌能够分解纤维素，用直尺测量出透明圈与菌落的直径（D），计算出透明圈与菌落直径的比值。1.2.2菌株复筛在种子培养基中接入初筛获得的分解纤维素能力较强的菌株，于180 r/min、28 ℃摇床中振荡培养48 h，得到种子液。在以水稻秸秆为碳源的固态产酶培养基中接入15%的种子液，28 ℃静置培养4 d。每隔一段时间振荡锥形瓶，使固态基质中菌株生长均匀。发酵产酶结束后，称取适量固体酶样加入装有适量去离子水的锥形瓶里，在180 r/min、28 ℃摇床振荡培养1 h，6 000 r/min离心10 min[24]，取上清液测羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活。参照国标QB 2583—2003测定羧甲基纤维素酶（CMC酶）、滤纸酶（FPA酶）活力[23]。酶活的定义：在（50±0.1）℃，一定pH值条件下，l mL粗酶液每分钟水解水稻秸秆产生相当于l μg葡萄糖的还原糖量，定义为1个酶活单位（U/g）[23]。1.2.3菌株紫外诱变选育吸取200 μL制备好的孢子悬浮液，加入灭菌的空平板中，放在超净工作台内距离紫外灯（30 W）约30 cm处，分别照射0、30、40、50、60、120、180、240、300 s。将照射时间不同的孢子悬浮液稀释至合适倍数，取0.2 mL均匀涂布于分离培养基平板上，用报纸包裹住平板，在28 ℃暗箱中培养，培养结束后，记录每个平板上的菌落数，计算致死率[23]。1.2.4菌种鉴定1.2.4.1形态学鉴定将得到的菌株采用平板划线法培养在PDA培养基平板上，平板上长出肉眼可见的菌落后，对菌落形态进行初步观察，挑取适量培养物制片，在显微镜下观察菌株的菌丝、孢子等形态特征。1.2.4.2分子鉴定使用真菌DNA提取试剂盒提取2株菌的DNA。以提取到的DNA为模板，用真菌内转录间隔区（ITS）序列扩增引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为通用引物进行PCR扩增[23]。1.2.4.3PCR扩增反应体系10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL，Taq聚合酶1.0 μL，1 μL 10 mmol/L dNTP，上下游引物各1.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 39.0 μL。PCR反应条件为预变性温度95 ℃、5 min；变性95 ℃、30 s；退火58 ℃、30 s；延伸72 ℃、1 min；循环数35；终延伸72 ℃、7 min[23]。将PCR扩增产物送至上海派森诺（Personalbio）生物科技有限公司进行测序，测序结果上传至NCBI进行GenBank比对，选择同源性高的序列，用MEGA11软件构建菌株系统发育树，鉴定菌株种属[23]。2结果与分析2.1产纤维素酶菌株的分离与初筛在以CMC-Na作为唯一碳源的分离培养基上稀释涂布土壤富集液，分离出31株菌株，通过比较纤维素分解菌的菌落和透明圈直径的大小，初步筛选出4株产纤维素能力较强的菌株，用于下一步复筛。2.2菌株复筛结果4个菌株透明圈与菌落直径比和酶活测定结果见表1。由表1可知，菌株HS5的FPA和CMC酶活均最高，故菌株HS5产酶能力在初筛得到的4株菌株中最强，其FPA酶活为（306.0±1.3）U/g，CMC酶活为（592.2±2.5）U/g。其次菌株1产酶能力较强，其FPA酶活与菌株HS6、HS7差距不明显，但其CMC酶活高达（523.8±3.4）U/g。因此后续试验以这两株菌作为研究对象。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.T001表14个菌株透明圈与菌落直径比和酶活测定结果菌株D透明圈/D菌落CMC酶活/(U/g)FPA酶活/(U/g)11.26523.8±3.4214.2±2.2HS51.29592.2±2.5306.5±1.3HS61.23469.8±3.7232.2±4.2HS71.19462.6±3.1221.4±1.72.3产纤维素酶的鉴定结果2.3.1菌株形态学鉴定结果（见图1）由图1（a）可知，菌株HS5的菌落平铺表面存在绒毛状菌丝，结构较疏松，菌落表面颜色由初期的黄色变为中后期的黄绿色，背部无色或呈浅褐色。由图1（b）可知，菌株1菌落表面呈绒毛状，其表面颜色随着培养时间的增加逐渐由浅绿色转变为深绿色，背部呈白色或淡黄色。由图1（c）可知，显微镜下的菌株HS5有较长的分生孢子梗、顶端为球形顶囊，顶囊上可看到许多小梗及分生孢子，孢子为卵圆形。由图1（d）可知，显微镜下可以看见菌株1的直且长的分生孢子梗，梗壁上无分生孢子附着，顶部是圆底烧瓶状的顶囊结构，其上半部分分布有单层小梗。根据菌株HS5和菌株1的菌落形态和显微形态观察结果，初步判断两菌为曲霉属[25]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F001图1菌株形态学鉴定结果2.3.2菌株的分子鉴定结果将扩增产物进行ITS测序，并与NCBI上现有的微生物基因序列进行了Blast分析[23]，发现HS5与黄曲霉（Aspergillus flavus）的同源性高达99.64%；菌株1与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的同源性高达100%。选择NCBI中与菌株同源性较高的菌株，下载其基因序列，使用MEGA11.0构建系统发育树。菌株HS5、1的ITS系统发育树见图2。图2菌株HS5和菌株1的ITS系统发育树10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F2a1（a）菌株HS510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F2a2（b）菌株1由图2可知，菌株HS5与Aspergillus flavus（AF036811.1）聚集在同一分支上，可信度为93，结合形态学特征，HS5被鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus）。菌株1与Aspergillus fumigatus（KT972124.1）聚集在同一分支上，可信度为96，结合形态学特征，菌株1被鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。因此，由HS5和1菌株的形态特征和ITS序列对比结果可知，HS5被鉴定为黄曲霉，菌株1被鉴定为烟曲霉。2.4紫外诱变选育2.4.1菌株HS5、1紫外诱变致死曲线（见图3）致死率在80%~90%之间能形成较有效的诱变效应，产生阳性突变菌株。由图3可知，两株菌的致死率均随照射处理时间的延长而增高。图3菌株HS5、1紫外诱变致死曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F3a1（a）菌株HS5的紫外诱变致死曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F3a2（b）菌株1的紫外诱变致死曲线由图3（a）可知，当照射时间为60 s时，菌株HS5致死率达到91.6%，因此可选择60 s作为菌株HS5的紫外诱变照射时间。由图3（b）可知，当照射时间为60 s时，菌株1致死率达到了90.8%，故选择60 s作为菌株1的紫外诱变剂量。2.4.2紫外诱变初筛结果（见表2、表3）两株菌株的最佳诱变剂量均为60 s，故以60 s作为诱变剂量，对菌株HS5、菌株1的孢子液进行紫外诱变处理后，吸取200 μL孢子液均匀涂布在分离培养基上，于避光、28 ℃条件下培养3 d，待长出单菌落后进行编号。由表2可知，菌株HS5共挑出44株菌落，其编号分别为UR-01~UR-44；菌株1有28株菌落，编号为URM-01~URM-28。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.T002表2HS5紫外诱变初筛结果菌株编号直径比菌株编号直径比HS51.29UR-231.15UR-011.23UR-241.23UR-021.25UR-251.34UR-031.12UR-261.16UR-041.06UR-271.16UR-051.19UR-281.15UR-061.13UR-291.29UR-071.63UR-301.18UR-081.26UR-311.28UR-091.32UR-321.19UR-101.29UR-331.18UR-111.16UR-341.14UR-121.16UR-351.09UR-131.08UR-361.08UR-141.20UR-371.08UR-151.33UR-381.10UR-161.08UR-391.42UR-171.22UR-401.06UR-181.21UR-411.17UR-191.09UR-421.14UR-201.19UR-431.15UR-211.13UR-441.23UR-221.2610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.T003表3菌株1紫外诱变初筛结果菌株编号直径比菌株编号直径比11.26URM-151.05URM-011.05URM-161.05URM-021.29URM-171.22URM-031.17URM-181.26URM-041.25URM-191.54URM-051.11URM-201.18URM-061.13URM-211.12URM-071.06URM-221.09URM-081.06URM-231.11URM-091.03URM-241.08URM-101.03URM-251.15URM-111.10URM-261.03URM-121.08URM-271.19URM-131.81URM-281.22URM-141.072.4.3紫外诱变后各菌株的酶活测定结果（见表4）对经紫外诱变处理60 s后所筛选出的菌株进行刚果红染色初筛，选择透明圈与菌落直径比值大的菌株测定其CMC、FPA酶活。由表4可知，紫外诱变菌株HS5得到UR-07、UR-09、UR-10、UR-15、UR-39共5株透明圈与菌落直径比值较大的突变株，其中UR-07的FPA酶活和CMC酶活有明显提高，分别提高了15.86%和16.68%。紫外诱变菌株1得到URM-13、URM-02、URM-19共3株透明圈与菌落直径比值较大的突变株，其中URM-13的FPA酶活和CMC酶活均高于出发菌株，分别提高了26.94%、19.03%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.T004表4紫外诱变后各菌株的酶活测定结果菌株编号FPA酶活CMC酶活菌株编号FPA酶活CMC酶活HS5306.5±1.3592.2±2.51214.2±2.2523.8±3.4UR-07355.1±2.1691.0±1.7URM-13271.9±6.7623.5±5.6UR-09313.0±3.7603.5±6.5URM-02189.1±4.3519.5±3.8UR-15320.3±1.5616.3±4.1URM-19232.1±4.3560.5±3.8UR-10302.7±5.2586.6±2.9UR-39278.1±3.4598.0±7.3U/g2.5诱变菌株的遗传稳定性对诱变所得菌株UR-07和URM-13进行遗传稳定性试验，结果见图4。由图4可知，UR-07和URM-13酶活都较稳定，表明两株突变株均具有良好的遗传稳定性，并且其菌落生长状况及菌落形态亦无变化[26]。图4突变菌株UR-07、URM-13产纤维素酶的遗传稳定性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F4a1（a）UR-0710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.015.F4a2（b）URM-133讨论作物秸秆是一种可再生的纤维素类生物质资源，拥有巨大的开发潜力。与液态发酵相比，固态发酵产纤维素酶具有发酵酶活高、污染小和用水量少等优点。刘佳[27]比较了菌株固态发酵与液态发酵产纤维素酶的差异，发现地衣芽孢杆菌固态发酵FPA酶活是液态发酵的1.71倍，表明某些菌株在固态状态下比在液态状态下产纤维素酶更具优势。本研究筛选得到的黄曲霉和烟曲霉，在液态发酵时几乎不产生纤维素酶，固态状态下FPA酶活分别为306.0、214.2 U/g，表明两株菌更适合在固态条件下产纤维素酶，这一发现能够应用于作物秸秆固态降解、堆肥方面，可以减少环境污染。邱永雄[28]利用筛选出的烟曲霉固态发酵产酶，纤维素酶活力为596.5 U/g。本研究初筛得到的烟曲霉固态发酵酶活为523.8 U/g，与邱永雄[28]的研究结果仅差12%；经紫外诱变后纤维素酶活有明显提升，是邱永雄[28]的研究结果的1.05倍。烟曲霉HS5利用水稻秸秆进行固态发酵时，生长旺盛，产纤维素酶能力较强，紫外诱变获得的突变株URM-13纤维素酶活力明显提升，能够显著降解水稻秸秆。Gaind等[29]筛选得到的耐热黄曲霉，固态发酵产纤维素酶活能达到268.92 U/g。本试验筛选得到的黄曲霉与其相比更具产酶优势，无论是初筛菌株还是诱变后的突变株，纤维素酶活均为Gaind等[29]研究结果的2.2~2.5倍，筛选菌株能够产生丰富的纤维素酶降解秸秆，提高秸秆饲料中粗纤维的消化率。本试验菌株HS5和1无须经过烦琐的突变处理，仅通过紫外诱变即可达到较好的效果。经紫外诱变得到的菌株UR-07和URM-13，产纤维素酶能力显著增强，可以应用于堆肥、生产饲料等生物质资源开发利用的前处理阶段；在改善生物质资源堆积、过剩问题，在提高资源高附加值转化方面具有广阔的应用前景。将菌株产生的纤维素酶应用于发酵饲料的前处理阶段，可以加快秸秆降解为可发酵性糖，供饲料生产菌株转化利用，提高饲料的适口性[30]、延长储存时间[31]等。在后续研究中，可进一步利用正交试验或响应面试验探究其最佳产酶培养条件；还可采用其他诱变育种方式，获得高产纤维素酶菌株；最终利用所得突变菌株进行秸秆降解率测定和发酵生产，分析其在实际应用中的作用效果。4结论本研究通过刚果红染色法初筛及固态发酵产酶复筛法，初步筛选出了两株产纤维素酶能力较强的菌株HS5和1，经鉴定为黄曲霉和烟曲霉。经过紫外诱变获得了高产纤维素酶的突变菌株，菌株HS5的突变菌株UR-07的FPA酶活和CMC酶活分别提高了15.86%和16.68%，菌株1的突变菌株URM-13的FPA酶活和CMC酶活分别提高了26.94%和19.03%。经连续5次传代培养的突变菌株UR-07和URM-13具有良好的遗传稳定性。经紫外诱变后，试验所得菌株提高了产纤维素酶的能力，在生产纤维素酶降解秸秆类物质方面拥有较大的开发利用前景，为秸秆资源的高效降解和应用提供了可利用的菌株，缩短秸秆降解周期。后续还可以继续优化提升黄曲霉、烟曲霉产纤维素酶效率，探究利用两株菌生产低成本的纤维素类物质降解菌剂的可行性，为合成高效微生物降解菌剂提供参考。