随着人们对食品安全的日益关注，加强畜禽类食品安全检测具有重要意义。喹诺酮类化合物具有抗菌活性强、范围广、副作用低等特点，广泛应用于畜牧业、水产等养殖业中[1-2]。但动物通过食物和其他方法获得的抗生素无法被身体完全吸收，30%~90%的抗生素与动物粪便一同排出体外，导致抗生素在畜禽粪便中残留[3-4]。研究表明，畜禽粪便可被加工制成有机肥料还田，如猪粪可加工成家禽饲料或应用于沼气发电等方面[5-7]。但畜禽粪便中含有的抗生素类药物仍存在活性，其最终的代谢产物会随着其产品如肥料和饲料等再次进入环境以及动植物体内，进而给人类带来直接或间接的危害[8-10]。据统计，我国目前年产畜禽粪污已超过240亿t[11]，且总量一直在稳定增长中。因此，检测畜禽粪便中抗生素残留具有重要意义。目前，国内外关于喹诺酮类药物的检测，普遍为牛奶、动物组织、婴幼儿食品等可食性样品，而关于畜禽动物抗生素水平的体外检测报道较少，且检测种类不全[12-13]。基于此，本试验建立了一种有效的液相色谱-串联质谱分析方法，可同时测定畜禽粪便中19种喹诺酮的残留量，以期为后期畜禽粪便的安全再利用提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂主要仪器：UPLC-MS/MS-8060超高效液相色谱串联质谱仪（日本岛津公司）、Genie PURIST TOC超纯水系统（上海乐枫生物技术有限公司）、GX-271固相萃取仪（美国Supelco公司）、BSA2202S电子天平（德国赛多利斯公司）、MGS-2200氮吹仪（东京理化公司）、X1离心机（德国赛默飞世尔公司）、MX-S涡混仪（北京大龙仪器有限公司）。主要试剂：氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、双氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、噁喹酸、氟甲喹、司帕沙星、达氟沙星、氟罗沙星、马波沙星、依诺沙星、奥比沙星、吡哌酸、洛美沙星、西诺沙星、萘啶酸标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer，纯度≥96%。色谱纯乙腈、色谱纯甲醇、色谱纯甲酸、QuEChERS净化盐包（5.0 g无水硫酸镁、2.50 g C18、2.50 g Carb）、0.22 μm滤膜均购自美国迪马公司。1.2样品制备沈阳周边的农场采集适宜的畜禽粪便于500 mL具塞锥形瓶中，-18 ℃避光密封保存。1.3样品提取与净化1.3.1样品的提取称取2 g（精确至0.01 g）样品，于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈（含5%甲酸），均质40 s，0~4 ℃、10 000 r/min离心10 min，使用10 mL乙腈（含5%甲酸）重复提取1次，合并上清液。1.3.2样品的净化将上清液加入QuEChERS净化盐包的离心管中，涡旋混匀。0~4 ℃、10 000 r/min离心10 min。准确吸取上清液5.0 mL，氮吹至近干，使用流动相溶液溶解残渣，过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。1.4样品分析1.4.1色谱条件色谱柱为岛津C18（100 mm × 2.1 mm，2.0 μm），样品室温度为4 ℃，柱温为40℃，进样体积为2.0 μL，流速为0.30 mL/min。流动相梯度为甲醇（A）和0.1％甲酸水溶液（B），梯度洗脱0~2 min B保持95%；2~12 min B由95%变化至5%；12~13 min B保持5%；13~14 min B由5%变化至95%；14~16 min B保持95%。1.4.2质谱条件离子源为ESI+，DL温度为250 ℃，加热块温度为400 ℃，接口温度为300 ℃，接口电压为3.0 kV，雾化气流量为3.0 L/min，干燥气流量为10.0 L/min，加热气流量为10.0 L/min。2结果与分析2.1色谱条件的优化结果2.1.1流动相的选择优化结果本试验对比了有机相（甲醇和乙腈），水相（水、5 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸、含0.1％甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液）的不同组合对19种喹诺酮的分离度的影响。结果表明，甲醇+0.1％甲酸水溶液作为流动相时，19种喹诺酮经梯度洗涤完全分离且具有更好的峰值形状和更高的灵敏度。因此，选择甲醇+0.1％甲酸水溶液作为流动相。此流动相条件下，19种喹诺酮类药物的保留时间和MRM图见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.F001图119种喹诺酮类药物的保留时间和MRM图2.1.2质谱条件的优化结果对19种浓度为0.1 μg/mL的喹诺酮的单标标准液进行全扫描，根据峰高、峰形以及信噪比等因素确定母离子、定性离子和定量离子，在MRM模式下，对Q1 Pre Bias、Q3 Pre Bias、和CE进行优化参数，确定质谱参数，结果见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.T001表119种喹诺酮的质谱参数项目母离子子离子驻留时间/msQ1 PreBias/VCE/VQ3 PreBias/V氧氟沙星362.2318.2*30-30-18-24362.2261.130-30-28-19诺氟沙星320.2302.1*30-16-20-23320.2231.130-16-46-28培氟沙星334.2316.2*30-13-20-24334.2290.130-13-16-22环丙沙星332.2314.1*30-13-16-24332.2231.030-13-44-18双氟沙星400.0356.0*30-17-20-25400.0299.030-17-29-28恩诺沙星360.3342.2*30-29-20-26360.3316.230-29-20-24沙拉沙星386.2368.1*30-15-20-28386.2299.130-15-25-23恶喹酸262.1244.1*30-30-18-30262.1216.030-30-32-26氟甲喹262.1244.1*30-30-16-18262.1202.030-30-36-23司帕沙星393.0349.0*30-30-21-24393.0292.030-30-21-24达氟沙星358.2340.1*30-14-20-26358.2255.030-14-42-29氟罗沙星370.0326.0*30-30-20-23370.0269.030-29-28-28马波沙星363.1320.0*30-14-15-22363.1345.030-14-20-24依诺沙星321.2303.1*30-16-20-23321.2203.930-16-48-23奥比沙星396.0352.0*30-17-19-24396.0295.030-16-25-20吡哌酸304.2286.1*30-30-18-22304.2215.130-30-38-24洛美沙星352.2265.0*30-18-22-20352.2308.230-18-16-23西诺沙星263.1245.1*30-21-16-19263.1189.030-21-30-22萘啶酸233.1215.1*30-30-14-26233.1187.030-30-28-22注：“*”为定量离子。2.2前处理条件的优化结果2.2.1提取溶剂的选择喹诺酮类药物在酸性条件下更加稳定。本研究比较了在乙腈中加入不同水平甲酸作为提取溶剂时19种喹诺酮的回收率，结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.T002表2不同酸性条件下19种喹诺酮的回收率项目甲酸水平0.5%1.0%5.0%10.0%氧氟沙星53.1~59.466.3~76.970.8~86.170.3~86.9诺氟沙星57.6~59.470.9~78.872.8~82.170.9~85.8培氟沙星51.6~57.161.2~74.082.2~107.181.2~94.0环丙沙星53.1~55.764.1~70.180.7~105.184.1~100.1双氟沙星45.4~55.868.1~70.882.4~90.186.1~90.6恩诺沙星50.2~52.066.7~71.589.0~101.684.5~101.5沙拉沙星40.2~57.877.7~82.871.6~91.575.5~82.6恶喹酸56.9~52.265.6~83.671.6~75.966.4~74.1氟甲喹52.5~66.770.2~76.674.8~101.272.0~95.5司帕沙星58.6~66.668.8~76.275.6~83.674.3~80.1达氟沙星47.5~61.762.0~81.270.2~86.671.9~82.0氟罗沙星55.4~62.564.7~80.678.8~86.280.3~91.5马波沙星55.8~60.262.4~70.872.0~81.269.1~80.0依诺沙星50.9~60.371.0~81.774.7~90.674.6~86.1奥比沙星56.9~69.963.5~85.372.4~90.872.6~84.9吡哌酸52.8~62.862.9~84.271.0~91.775.5~80.5洛美沙星52.6~67.369.8~77.873.5~85.369.4~84.4西诺沙星51.1~67.467.8~73.972.9~84.274.2~85.0萘啶酸51.5~63.863.1~80.879.8~87.874.9~84.6%由表2可知，随着提取溶剂中甲酸含量增加，19种喹诺酮的回收率也逐步提升，当提取溶剂中甲酸含量增加至10%时，19种喹诺酮回收率为66.4%~100.1％，提取溶剂中甲酸含量为5%时，19种喹诺酮的回收率70.2%~107.1％，与甲酸含量为10%相差较小。因此，本研究采用乙腈（含有5％甲酸）作为提取溶剂。2.2.2净化方法的选择QuEChERS是目前残留检测中常见的净化方法。本研究以鸡粪、猪粪、牛粪等3种基质为例，考虑到这几种粪便中可能存在水分、脂肪、蛋白质、色素以及一些特殊的杂质。因此，选择具有吸附油脂和蛋白质作用的C18固相萃取柱，吸附色素的Carb固相萃取柱以及吸附一些极性强杂质的氨基固相萃取柱作为对比，筛选净化畜禽粪便的方法。不同净化方法下19种喹诺酮的回收率图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.F002图2不同净化方法下19种喹诺酮的回收率由图2可知，采用Carb固相萃取柱净化的19种喹诺酮的回收率明显低于QuEChERS净化的回收率。原因是QuEChERS净化盐包中同时使用了3种净化材料，可以更充分地净化样品，而固相萃取柱因为成分比较单一，净化不够充分，且吸附性更强，导致回收率偏低。使用QuEChERS净化的19种喹诺酮的回收率稳定在65.6%~97.3%之间。因此，本研究采用QuEChERS为净化方法。2.2.319种喹诺酮的基质效应（见图3）为确保定量结果的准确性，基质效应是需要考察的第一要素。由图3可知，19种喹诺酮中存在明显的基质效应，其中培氟沙星和环丙沙星等具有基质抑制效应，达氟沙星和氟罗沙星等存在基质增强效应。因此，本研究采用空白基质加标曲线校正，以克服基质效应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.F003图319种喹诺酮的基质效应2.3方法学验证以被测组分的浓度为横坐标，被测组分的峰面积为纵坐标拟合工作曲线，得到相关系数、根据信噪比（S/N）计算方法的检出限和定量限。根据检出限的不同，分别添加检出限的1倍、2倍和10倍制成模拟的加标样品，测定19种喹诺酮的回收率、变异系数。19种喹诺酮的曲线范围、相关系数、检出限、定量限、回收率、相对标准偏差（RSD）见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.T003表319种喹诺酮的曲线范围、相关系数、检出限、定量限、回收率、相对标准偏差项目曲线范围/(μg/L)相关系数检出限/(μg/kg)定量限/(μg/kg)阴性基质/(μg/kg)回收率/%相对标准偏差/%氧氟沙星1~1000.994 10.150.5ND76.3~86.95.0~6.6诺氟沙星2~1000.996 60.301.0ND70.9~88.86.9~9.7培氟沙星1~1000.994 70.150.50.287.2~108.25.6~7.3环丙沙星2~1000.997 90.301.0ND84.1~107.14.6~7.9双氟沙星2~1000.997 70.301.0ND88.1~80.85.7~6.6恩诺沙星2~1000.997 90.301.0ND76.7~81.55.1~8.1沙拉沙星2~1000.999 10.301.0ND77.7~92.83.2~8.7噁喹酸2~1000.997 60.301.00.568.6~74.13.5~8.4氟甲喹1~1000.999 40.150.5ND72.0~87.75.3~7.2司帕沙星2~1000.999 40.301.0ND74.3~85.17.1~8.4达氟沙星5~1000.997 70.602.0ND71.9~82.04.0~6.8氟罗沙星2~1000.999 10.301.0ND67.3~81.75.9~7.8马波沙星2~1000.997 70.301.0ND69.1~90.06.9~8.4依诺沙星5~1000.997 50.602.0ND64.8~88.16.7~8.6奥比沙星2~1000.997 90.301.01.673.1~86.94.2~5.6吡哌酸2~1000.999 50.301.0ND65.5~90.55.3~7.7洛美沙星2~1000.997 90.301.0ND79.4~86.63.9~6.7西诺沙星2~1000.999 00.301.0ND66.2~87.03.4~8.0萘啶酸1~1000.997 60.150.5ND79.9~83.55.4~8.3注：ND表示未检出。由表3可知，19种喹诺酮的相关系数均高于0.994 1，回收率为64.8%~108.2%，相对标准偏差为3.2%~9.7%，方法检出限为0.15~0.60 μg/kg，定量限为0.5~2.0 μg/kg。2.4实际样品中19种喹诺酮的残留量（见表4）使用本方法分别对沈阳周边养殖户的畜禽粪便开展19种喹诺酮的检测，样品包括20份鸡粪、20份猪粪、20份牛粪。由表4可知，19种喹诺酮在20份牛粪均未检出，20份鸡粪中有4份样品有检出，20份猪粪中有2份样品有检出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.022.T004表4实际样品中19种喹诺酮的残留量项目检出数量/份含量/(μg/kg)牛粪鸡粪猪粪氧氟沙星————诺氟沙星————培氟沙星—3—0.5~1.0环丙沙星—322.0~4.0双氟沙星————恩诺沙星————沙拉沙星————噁喹酸—211.0~2.5氟甲喹————司帕沙星————达氟沙星————氟罗沙星————马波沙星————依诺沙星————奥比沙星—3—1.5~2.3吡哌酸————洛美沙星————西诺沙星————萘啶酸————注：“—”表示未检出。3讨论现行国家标准中喹诺酮类化合物的检测方法GB 29692—2013[14]利用高效液相色谱检测牛奶中11种喹诺酮类物，定量限为15~50 μg/kg。GB/T 21312—2007[15]利用固相萃取柱和高效液相色谱串联质谱法同时检测动物源性食品中14种喹诺酮类化合物，其中动物组织的定量限为3~10 μg/kg，鸡蛋和牛奶2~5 μg/kg。GB/T 20366—2006[16]利用液相色谱串联质谱法检测，但仅适用于家禽、兔子、鱼、虾和其他动物产品，可同时检测11种喹诺酮类物，定量限1.0 μg/kg。梁海斌[17]利用QuEChERS-高效液相色谱法检测不同畜禽产品中5种氟喹诺酮类的药物残留，最低定量限为2~10 μg/kg。程传民等[18]采用全自动在线固相萃取-高效液相色谱法同时检测畜禽产品中6种氟喹诺酮类药物残留量，定量限均为2.5 μg/kg。目前提取方法普遍选择固相萃取法，与QuEChERS提取法相比，该提取方法耗时长，检测成本更高[19-20]。本研究建立的分析方法精度更低，且简便、快速、灵敏、重现性好，符合试验分析要求，具有一定的创新和推广价值，可为后期畜禽粪便的再利用以及分析畜禽动物体内抗生素代谢情况提供参考。4结论本研究建立了同时测定畜禽粪便中19种喹诺酮类抗生素残留的方法，检出限达0.15~0.6 μg/kg，定量限达0.5~2.0 μg/kg，精度低，简便、快速、灵敏、重现性好。