薯蓣科薯蓣属山药为一年生或多年生草本藤本植物[1]，主要分布于我国南部和东部地区，在广西、山东、河北、河南等多个省份均有种植[2]。山药的地下根茎作为食用部分，其茎叶常丢弃田间，造成了极大的资源浪费[3]。山药叶中含有植物多酚类成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、解毒等活性[4-5]。植物多酚广泛用于食品、动物生产、饲料添加等行业[6]。孙廷等[7]研究发现，日粮中添加植物多酚提高育肥猪的日增重和饲料效率，改善肌肉品质。刘梅等[8]研究发现，日粮中添加茶多酚能够提高肉仔鸡的生长性能及抗氧化能力。李伟等[9]研究发现，日粮中添加桉叶多酚能够明显改善肉鸡腿肌肉质。目前，多酚的提取方法主要包括溶剂提取法、酶辅助提取法、微波辅助提取法和超声辅助提取法等[10]。超声提取法通过高频震动及空化效应破坏细胞结构、加快细胞内含物释放，具有操作简单、提取效果好等优点[11-12]。陈旭等[13]采用超声波辅助提取山楂叶多酚，在最优提取条件下山楂叶多酚提取率可达0.66%。王冬梅等[12]采用超声细胞破碎法辅助提取山果皮果中的熊果酸，在最优提取条件下熊果酸提取量可达5.15 mg/g。本试验采用超声波细胞破碎仪研究山药叶多酚提取工艺的优化，分析山药叶多酚的DPPH自由基清除能力及对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制能力，初步探究山药叶多酚的抗氧化能力和体外抑菌能力，为山药叶的综合利用与开发提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂山药叶（铁棍山药）采自山东省济宁市汶上县山药种植基地，由山东中医药大学张永清教授鉴定为薯蓣科薯蓣属山药的叶片。没食子酸分析对照品（北京索莱宝科技有限公司），福林-酚试剂（上海源叶生物科技有限公司），DPPH（东京化成工业株式会社），大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633（山东拓普生物工程有限公司），硫酸庆大霉素（山西金馥康生物药业股份有限公司），2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色液（上海源叶生物科技有限公司），总抗氧化能力（T-AOC）测试盒（2, 2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）法，南京建成生物工程研究所）。1.2主要仪器设备超声波细胞破碎仪（郑州比朗仪器有限公司），万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），Sorvall ST 8R型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司），TH2-C-1型摇床（苏州培英试验设备有限公司），MJ-78A型高压蒸汽灭菌锅（上海施都凯仪器设备有限公司），酶标仪（美国Molecuar Devices有限公司）。1.3试验方法1.3.1原料制备将山药叶清洗，置于60 ℃烘箱12 h，粉碎过40目筛，干燥保存备用。1.3.2提取工艺称取1.0 g山药叶粉末，加入适量乙醇，采用超声波细胞破碎仪进行破碎处理，浸提后9 500 r/min离心10 min，取上清液定容至25 mL，备用。1.3.3山药叶多酚的测定以没食子酸为标准品，采用福林酚比色法测定山药叶多酚含量[14-15]。没食子酸标准曲线回归方程：Y=81.5X+0.156 2，R2=0.998 9。根据标准曲线计算多酚得率，计算公式如下：Y=c×N×VW (1)式中：Y为多酚得率（mg/g）；c为测定液多酚质量浓度（g/L）：N为稀释倍数：V为提取液体积（mL）；W为干粉质量（g）。1.3.4单因素试验根据单因素试验变量法则，分别考察超声时间（5、7、9、11、13 min）、超声功率（180、240、300、360、420 W）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、浸提时间（20、30、40、50、60 min）、浸提温度（40、50、60、70、80 ℃）和料液比（10、15、20、25、30 mL/g）对山药叶多酚得率的影响。1.3.5响应面试验设计基于单因素试验结果，选择超声时间、超声功率和乙醇浓度3个提取条件为影响因素，使用Design-Expert 13.0软件设计响应面优化试验，试验因素水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.T001表1响应面设计方案水平A超声时间/minB超声功率/WC乙醇浓度/%-17240500930060111360701.3.6山药叶多酚的抗氧化活性参考沈龙等[16]试验方法测定DPPH自由基清除能力，ABTS自由基清除能力采用总抗氧化能力试剂盒（ABTS法）测定。1.3.7山药叶多酚的抗菌活性参考陈克克等[17]试验方法测定山药叶多酚提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。1.4数据统计与分析采用Excel软件对数据进行整理，Design-Expert 13.0软件进行响应面分析设计。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1超声时间对山药叶多酚得率的影响（见图1）由图1可知，随着超声时间的增加，多酚得率呈现上升趋势，于9 min时多酚得率达到峰值，为17.1 mg/g，此后随着超声时间的延长，多酚得率逐渐下降。可能是随超声时间延长，部分多酚发生降解，导致得率下降[18]，因此最佳超声时间为9 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F001图1超声时间对山药叶多酚得率的影响2.1.2超声功率对山药叶多酚得率的影响（见图2）由图2可知，随着超声功率的增加，多酚得率呈现上升趋势，于300 W时达到峰值，为17.2 mg/g。此后，随着超声功率的增加，多酚得率逐渐下降，可能是超声波引起的“空化效应”随超声功率的增加而增加，使山药叶中酚类物质在溶液中扩散速率加快[19]。当功率超过300 W后，过高的“空化效应”会使提取液中的多酚类成分受到破坏，同时杂质溶出增加[20]，因此最佳超声功率为300 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F002图2超声功率对山药叶多酚得率的影响2.1.3乙醇浓度对山药叶多酚得率的影响（见图3）由图3可知，随着乙醇浓度的增加，多酚得率呈现上升趋势，于60%时达到峰值，为17.8 mg/g。此后，随着乙醇浓度的增加，多酚得率逐渐下降。可能是随着乙醇浓度的增加，改变了提取溶剂的极性，使山药叶多酚的得率下降，因此最佳乙醇浓度为60%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F003图3乙醇浓度对山药叶多酚得率的影响2.1.4浸提时间对山药叶多酚得率的影响（见图4）由图4可知，随着浸提时间增加，多酚得率呈现上升趋势，于50 min时达到峰值，为17.0 mg/g。此后，随着时间增加，山药叶多酚得率略有下降。可能是随着浸提时间的延长，提取液与山药叶中多酚达到动态平衡，增加浸提时间会使溶出的多酚氧化分解[21]，因此最佳浸提时间为50 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F004图4浸提时间对山药叶多酚得率的影响2.1.5浸提温度对山药叶多酚得率的影响（见图5）由图5可知，随着浸提温度的升高，多酚得率呈现上升趋势，于60 ℃时达到峰值，为17.11 mg/g。此后，随着温度升高，多酚得率逐渐下降。可能是温度增加使分子的有效碰撞机会增加，有利于山药叶中多酚类成分的溶出，继续增加温度，会促进山药叶中其他杂质溶出和提取液中热敏类多酚化合物发生降解、氧化[22]，因此最佳浸提温度为60 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F005图5浸提温度对山药叶多酚得率的影响2.1.6液料比对山药叶多酚得率的影响（见图6）由图6可知，随着液料比升高，多酚得率略有下降后上升，当液料比为25 mL/g时达到峰值，为17.3 mg/g。此后，随溶剂用量增加多酚得率逐渐下降。可能是随着液料比的增加，在提取过程中溶出了其他非多酚的物质，从而导致山药叶多酚得率下降[20]，因此最佳液料比为25 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F006图6料液比对山药叶多酚得率的影响2.2响应面优化山药叶多酚提取试验2.2.1响应面试验结果根据单因素试验结果，设置浸提时间50 min、浸提温度60 ℃、液料比25 mL/g固定不变，选用超声功率、超声时间、乙醇浓度为自变量，以山药叶多酚得率为响应值进行优化。具体试验方案及结果见表2。本试验采用Design-Expert 13.0软件对表2结果值进行响应面回归分析，得到山药叶总多酚得率（Y）的二次多项回归方程为：Y=18.95-0.093 8A+0.030 0B-0.411 3C+0.067 5AB-0.050 0AC-0.017 5BC-0.315 5A2-0.098 0B2-0.800 5C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.T002表2响应面试验结果编号A超声时间/minB超声功率/WC乙醇浓度/%Y多酚得率/(mg/g)172406018.722112406018.36373606018.574113606018.48573005018.256113005018.20773007017.568113007017.31992405018.391093605018.561192407017.571293607017.671393006018.891493006018.951593006018.801693006019.201793006018.89响应面试验方差分析结果见表3。由表3可知，模型中多酚得率与各变量之间回归关系具有显著性（P0.01），失拟项不显著（P0.05），表明该试验数据和模型符合度高，可用于模拟山药叶多酚的得率。根据回归模型，C、A2、C2达到差异显著水平（P0.01），A、B、AB、BC、AC、B2差异不显著（P0.05）。各因素对山药叶多酚得率影响因素的大小次序为：乙醇浓度超声时间超声功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.T003表3响应面试验方差分析结果项目平方和自由度均方和F值P值模型4.810 090.534 134.520 00.000 1A0.070 310.070 34.540 00.070 5B0.007 210.007 20.465 40.517 0C1.350 011.350 087.460 00.000 1AB0.018 210.018 21.180 00.313 7AC0.010 010.010 00.646 40.447 8BC0.001 210.001 20.079 20.786 5A20.419 110.419 127.090 00.001 2B20.040 410.040 42.610 00.150 0C22.700 012.680 0174.400 00.000 1残差0.108 370.015 0失拟项0.016 230.004 60.234 10.868 6净误差0.092 140.023 0校正项4.910 016注：P0.01表示影响极显著，P0.05表示影响显著；R2=0.978 0，R2adj=0.949 6。2.2.2最佳提取工艺验证由Design-Expert 13.0求解回归方程，得出最优的山药叶多酚提取方案为：超声时间8.77 min、超声功率308.13 W、乙醇浓度57.45%，在此条件下山药叶多酚得率可达到19.01 mg/g。考虑到操作的局限性，确定试验方案为：超声时间9.0 min、超声功率310 W、乙醇浓度57%。在此条件平行测定3次，验证性试验结果的多酚平均得率为18.88 mg/g，与预测值接近，验证此模型可用来对山药叶多酚成分进一步提取优化。2.2.3各因素互作对山药叶多酚得率的影响（见图7~图9）根据试验结果，通过Design-Expert 13.0软件绘出响应面与等高线图。响应面坡度越陡峭，显著性越大；反之，显著性越小。等高线形状为椭圆形则表示两因素交互作用强，圆形则相反[23]。由图7~图9可知，这3组交互作用的等高线图形状接近圆形，山药叶多酚得率受各因素交互影响作用不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F007图 7超声功率与超声时间对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F008图8乙醇浓度与超声时间对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F009图9乙醇浓度与超声功率对多酚得率的影响2.3抗氧化试验结果2.3.1山药叶多酚对DPPH自由基的清除率（见图10）由图10可知，山药叶多酚浓度在0.25~1.00 g/L时，对DPPH自由基清除率随浓度增加明显提高。此后，随着浓度的增加，山药叶多酚对DPPH自由基清除率趋于稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F010图10山药叶多酚对DPPH自由基的清除率2.3.2山药叶多酚对ABTS自由基的清除率（见图11）由图11可知，山药叶多酚浓度在0.5~1.5 g/L时对ABTS自由基清除率随浓度增加明显提高。此后，随着浓度的增加，山药叶多酚对ABTS自由基清除率趋于稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.F011图11山药叶多酚对ABTS自由基的清除率2.4抑菌试验结果（见表4）由表4可知，山药叶多酚提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的杀菌作用强于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.017.T004表4山药叶多酚对细菌的MIC和MBC菌种山药叶多酚硫酸庆大霉素MICMBCMICMBC大肠杆菌12.5025.000.400.40枯草芽孢杆菌12.5025.000.100.20金黄色葡萄球菌12.5012.501.252.50g/L3结论本试验以山药叶为研究对象，山药叶多酚得率为指标，基于单因素试验结果，进行3因素3水平的响应面试验，各因素对山药叶多酚得率的影响次序为乙醇浓度超声时间超声功率。经调整得到山药叶多酚最佳提取工艺为：超声时间9.0 min、超声功率310 W、乙醇浓度57%、浸提时间50 min、浸提温度60℃、液料比25 mL/g。此条件下山药叶多酚得率可达到18.88 mg/g。山药叶多酚具有较好的抗氧化活性。体外抑菌试验表明，山药叶多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有较强抑制能力。因此，山药叶作为非药用部位具有较好的开发潜力。