在对致病细菌引起的流行疾病进行治疗的过程中，抗生素的过度使用会导致机体对药物产生耐药性。因此需要开发绿色新型抗菌剂替代传统抗生素[1]。月桂酸（LA）应用于动物生产中具有易消化、易吸收、迅速供能、抗菌、抗病毒等特点[2-5]。LA及其衍生物可用作广谱抑菌剂和抗病毒剂[6]，但其抗菌性不高。金属盐对金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌均具有抑制作用，铜盐的杀菌活性最强[7]。引入金属离子可以提高LA及其衍生物的活性。铜参与动物生长发育中酶促反应、氧转运、合成血红蛋白等过程，是维持动物机体环境稳定不可或缺的微量矿物元素[8]。低剂量月桂酸铜（LAC）能够缓解致病菌对蛋鸡肠道菌群紊乱、肠道炎症和氧化应激[9]。但目前关于LAC的工艺生产、抑菌性能方面研究甚少。本文采用一步法合成LAC，在单因素试验基础上，进行正交试验优化合成工艺，以期获得生产最佳工艺，使用FTIR、XRD、TG、SEM、XPS对结构和形貌进行分析，探讨了LAC在模拟胃环境中的稳定性，使用细菌总数测定法和最小抑菌浓度法探究相同质量的LA和LAC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果，为其在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器设备1.1.1试验材料月桂酸钠（SL）（AR，上海麦克林生化科技有限公司），五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）（AR，天津市百世化工有限公司），大肠杆菌（E. coli）和金色葡萄球菌（S. aureus）取自本单位生化实验室。1.1.2仪器设备Spectrum傅里叶红外光谱仪（美国PerkinElmer公司），Ultima Ⅵ型X射线粉末衍射仪（日本理学株式会社），Olympus CX41RF显微镜（日本Olympus公司），SU-8010扫描电子显微镜（日本Hitachi公司），TGA2同步热分析仪（美国梅特勒-托利多公司），Scientific K-Alpha X射线光电子能谱仪（美国Thermo公司），DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器公司）。1.2试验方法1.2.1LAC的制备采用热水溶剂法、一步法制备LAC[10]，化学方程式为2CH3(CH2)10COONa+CuSO₄=Cu[CH3(CH2)10COO]2+NaSO4。准确称取一定量的SL并溶于水中，40 ℃加热搅拌均匀制得SL溶液，调节至一定的pH值。另取一定量CuSO4·5H2O加入其中。在50 ℃下水浴磁力搅拌下，将CuSO4溶液逐滴加入SL溶液中。将混合溶液在一定温度下持续加热一定的时间。反应结束，使用真空抽滤机对悬浊液进行抽滤分离。采用60 ℃以上的热水充分洗涤5~6次，重复抽滤分离，以去除多余的原料。将样品置于50 ℃下的热风烘箱中干燥8 h，称量并计算LAC产率。LAC产率=实际称量值/理论产量×100%(1)1.2.2单因素试验与正交试验设计选取温度、pH值、时间、反应物配比4个因素进行单因素试验制备LAC。单因素试验因素水平见表1。根据单因素试验结果，设计L9(34)正交试验。正交试验因素水平设计见表2。以LAC产率为标准，确定制备LAC的最佳工艺。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.T001表1单因素试验因素水平水平时间/min温度/℃pH值n（Cu2+）∶n（SL）145529.00.8∶2260559.50.9∶23755810.01.0∶24906010.51.1∶251056211.01.2∶210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.T002表2L9（34）正交试验因素水平设计水平A时间/minB温度/℃C pH值D n（Cu2+）∶n（SL）160559.00.9∶2275589.51.0∶23906010.01.1∶21.3LAC的形貌观察将各5 mg CuSO4·5H2O和LAC平铺在载玻片上，盖上盖玻片，显微镜进行形貌观察。将2 mg LA、SL和LAC分别分散于导电胶上，在样品表面喷涂金粒子后，使用SEM观察样品的形貌和粒度分布。1.4LAC的结构表征根据KBr片剂法，使用傅里叶红外光谱在4 000~400 cm-1范围对LA、SL和LAC样品进行FTIR光谱表征，扫描分辨率为4 cm-1；以Cu靶Kα为辐射源，使用X射线粉末衍射仪对LA、SL和LAC进行XRD分析，波长（λ）为0.154 06 nm，管电压40 kV，管电流40 mA；在N2保护下，使用同步热分析仪以10 ℃/min的升温速率考察LA、SL和LAC在40~800 ℃范围内的热稳定性。采用X射线光电子能谱（XPS）对LA、SL和LAC进行XPS分析，采用Al Kα射线在电压12 kV、电流6 mA时以C1s=284.8 eV结合能为能力标准进行荷电校正。1.5LAC在胃液模拟环境中的稳定性由于饲料在动物的胃环境消化时间为2~4 h，本试验以CuSO4·5H2O为对照，通过测定溶液中Cu2+的释放量确定LAC在模拟胃中180 min的稳定性。准确配制500 mL模拟胃液的酸性介质（0.1 mol/L HCl，pH值1.0），装入溶出瓶中，根据溶出仪操作要求调整机械桨叶到最合适的高度。再将100 mg LAC样品和等量的CuSO4加入模拟胃液中，以37 ℃恒温消化180 min。每20 min从溶出瓶中收集15 mL样品溶液到玻璃管中，以补充丢失的溶液。将收集的样品溶液通过0.45 μm PVDF滤膜过滤，采用电感耦合等离子体光谱仪测定溶液Cu2+含量。每个处理平行3次试验，计算Cu2+释放率[11]。Qn=Vs∑k=1n-1ck+VrcnW×100%(2)式中：Vs为样品的测定体积（mL）；Vr为介质体积（mL）；c为EDTA测定的铜含量（%）；n为收集样品的次数（次）；W为加入样品中的铜含量（%）。1.6LAC的抗菌活性评价1.6.1LAC的抗菌活性的测定采用细菌总数测定法[12]比较LA和LAC对E. coli和S. aureus的抑菌活性。配制20 mL琼脂固体培养基，并放置在高压灭菌锅中灭菌20 min（0.1 MPa，121.5 ℃）。在无菌操作工作台中，将药品在琼脂培养基未凝固前加入，使其均匀分散后倒入无菌玻璃培皿中，冷却凝固。将微生物培养至生长对数期（109 CFU/mL），稀释菌液至103 CFU/mL。吸取200 μL菌液注入琼脂上，使用玻璃涂布棒将菌液涂抹均匀分散在培养基表面，置于37 ℃培养箱中孵化24 h。取出培养皿，手动计算琼脂培养基中的菌落数。每个处理平行3次。1.6.2LAC的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定将一步法合成的不同质量的LAC添加至灭过菌的琼脂固体培养基中，得到质量浓度为0、0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 g/L LAC琼脂培养基。吸取200 μL菌液置于琼脂上，均匀涂布，培养24 h，观察琼脂培养基上菌株生长的情况。平行3次试验取平均值。2结果与分析2.1单因素试验结果（见图1）图1pH值、温度、时间、n（Cu2+）∶n（SL）对LAC合成产率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F1a1（a）合成pH值对LAC合成产率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F1a2（b）温度对LAC合成产率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F1a3（c）时间对LAC合成产率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F1a4（d）n（Cu2+）∶n（SL）对LAC合成产率的影响由图1（a）可知，在pH值高于8.5低于9.5时，LAC合成产率随pH值的升高逐渐提高。当pH值为9.5时，LAC合成产率最高，为71.67%；当pH高于9.5时，LAC合成产率下降，这是因为pH值会影响脂肪酸盐晶体生长[13-14]。当环境pH值在9.5左右时，是适合LAC结晶的酸碱环境[15]。由图1（b）可知，温度小于58 ℃时，随温度升高，LAC合成产率升高；大于58 ℃时，随着温度升高产率反而呈现下降后上升的趋势，原因可能是LAC的合成为吸热反应，温度升高，浓度提升[16]。当温度高于58 ℃后，部分LAC产物可能发生水解。由图1（c）可知，在反应时间为75 min时，LAC合成产率最高，为76.04%。由图1（d）可知，反应物随着Cu2+配比的增加合成产率呈现显著上升后相对平稳的趋势。当n（Cu2+）∶n（SL）为1∶2时，LAC合成产率最高，为75.47%，之后再增加Cu2+，并未明显提高LAC合成产率。2.2正交试验极差与方差分析结果（见表3、表4）由表3、表4可知，LAC制备工艺的最优组合为A1B2C3D3，即合成时间60 min、合成温度58 ℃、pH值10、n（Cu2+）∶n（SL）1.1∶2。经试验验证，LAC合成产率为77.12%。影响合成产率4个因素的主次关系为C＞B＞A＞D。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.T003表3正交试验极差分析结果项目ABCDLAC合成产率/%1111169.40±0.652122276.50±0.733133374.10±0.164212373.30±0.225223174.60±0.146231266.70±0.367313271.30±0.378321370.60±0.439332168.90±0.45k173.3371.3368.9070.97k271.5373.9072.9071.50k370.2769.9073.3372.67R3.074.004.431.7010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.T004表4正交试验方差分析结果项目平方和自由度均方Ｆ值P值误差5.1180.283A42.747221.37375.4350.01B73.927236.963130.4590.01C107.527253.763189.7530.01D13.60726.80324.0120.01注：P0.01表示影响极显著。2.3LAC的形貌分析CuSO4·5H2O、LAC、SL、LA电子显微镜图、宏观图、SEM图见图2。由图2可知，CuSO4·5H2O是蓝色透亮的方形晶体，结晶度高。LAC为蓝色棒状晶体，形态与CuSO4具有明显差异，这进一步证实了本试验制备生产的LAC与CuSO4非同一物质。宏观上，SL与LAC分别为白色粉末和蓝色粉末状，这是由样品的微观结构和材料成分发生变化造成的。采用SEM进一步观察LA、SL、LAC的微观形貌，SL为白色棒状纤维[17]，LAC为尺寸范围约为500 nm棒状晶体。LAC的形状和分布可能是由于聚合作用和较强的疏水性导致[18]。结果表明，LA与Cu参与了分子间的相互作用并可能形成新的产物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F002图2CuSO4·5H2O、LAC、SL、LA电子显微镜图、宏观图、SEM图2.4LAC的FTIR分析（见图3）对LA、SL和LAC进行FTIR分析见图3。由图3可知，2 958、2 922、2 852 cm-1处的吸收峰为甲基（—CH3）的特征峰，而740.6 cm-1处出现的吸收峰是分子中—CH2—的特征峰。LA因羧酸羟基的缔合作用形成氢键，致使O—H伸缩振动在2 200~3 000 cm-1处形成很宽的COOH泛频区吸收峰，940 cm-1处吸收峰是羧基面外弯曲振动引起。与LA相比，LAC中甲基（—CH3）和亚甲基（—CH2）仍存在，而2 200~3 000 cm-1羧基泛频区吸收峰和940 cm-1处的羧基面外弯曲振动峰消失，说明COOH已经去质子化。此外，LA中COOH的C=O和C—O特征峰分别为1 703、1 297 cm-1，这两个振动吸收峰在配合物LAC中消失，出现2个新的吸收峰，分别是位于1 582 cm-1的羧基反对称vas（COO—）和位于1 441 cm-1的对称伸缩谱带vs（COO—），表明羧酸与Cu配位成功，形成了LAC。此时R—COO—与Cu主要以络合结构形式结合[19]。LAC的结构式见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F003图3LA、SL和LAC的FTIR分析谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F004图4LAC的结构式2.5LAC的XPS分析为进一步证实产物的成功形成，对LA、SL和LAC进行XPS分析，结果见图5。由图5可知，LA样品中明显存在C1s和O1s信号；SL样品中存在C1s、O1s和Na1s峰；XPS的扫描结果表明LAC主要由C、O、Cu组成，直接证明了Cu2+成功配位。Cu的分谱图显示出4个特征峰，932.7、952.3 ev对应Cu0；位于934.6、954.4 eV对应Cu2+，表明Cu元素为Cu0和Cu2+价态[20]。由图5（b）、图5（d）、图5（g）可知，LA样品上的3个子峰的结合能分别为288.3、286.1、284.2 eV，分别对应样品分子的O—C=O键、C=O键和C—C键的峰。相比之下，LAC的能谱分析显示出C=O峰（284.53 eV）偏移至更低的结合能，表明Cu配位提高了C原子的外层电子密度，提高了碳核对1s电子的屏蔽作用，降低了碳核对1s电子的引力，这结果与LA的能谱中的C=O峰一致[21]。因此，结合整个XPS谱图分析，证实了LAC的成功形成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F005图5LA、SL、LAC的XPS图谱2.6LAC的XRD分析使用X射线粉末衍射（XRD）表征LA、SL和LAC的图谱，结果见图6。与LA和SL相比，除了部分重叠的峰外，LAC的衍射图中还出现部分与LA和SL不重叠且强烈而尖锐的布拉格峰，为新的晶体结构，产物粒径较小，进一步证实了LAC的生成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F006图6LA、SL、LAC的XRD图谱2.7LAC的热分析LA、SL和LAC的热分析见图7。由图7可知，LA在115 ℃时，开始失重，直至240 ℃基本完全分解。SL在71~163 ℃范围内首次失重归结于其吸附的水分蒸发，356.3~715.5 ℃范围内出现第二次失重，是SL的主体部分的氧化分解。而LAC在160~288 ℃是LAC的主体碳链发生分解氧化的放热反应；在288~361 ℃失重是由未分解氧化彻底的有机部分C12H23O2-配体碎片分解造成[22]；在581~700 ℃范围内的第三阶段是由于LAC生成氧化铜后，继续发生氧化还原反应。图7LA、SL、LAC热分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F7a1（a）TG曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F7a2（b）DTG曲线由此可见，与LA相比，LAC提高了热稳定性，较SL更好降解。2.8LAC在胃液模拟环境的稳定性分析CuSO4·5H2O和LAC在模拟胃液中Cu2+的缓释率见图8。为确定LAC在胃液中的缓释性能，以CuSO4·5H2O为对照组，采用透析扩散法测量样品在胃液中Cu2+的释放速率，在模拟胃液（pH值=1.0）的过程中，CuSO4·5H2O迅速溶解，在80 min时，释放率达92.28%，表明CuSO4不具有耐酸性。在180 min后，LAC累积Cu2+释放率为75.60%，这表明单位时间内LAC较普通CuSO4的利用率提高了16.68%，这可能与LAC链和COO—Cu配位键具有良好稳定性有关[23]。CuSO4·5H2O在胃液中的溶解性强，寿命很短，所以不适合直接作为治疗胃肠道病菌药物使用。而LAC在胃环境中具有更长的寿命，甚至进入肠道后可持续释放，造成病原体Cu2+中毒，起抑菌作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F008图8CuSO4·5H2O和LAC在模拟胃液中Cu2+的缓释率2.9LAC的抗菌分析使用细菌总数测定法对本研究制备的LAC和LA的抑菌效率进行比较，结果见图9。由图9可知，E. coli和S. aureus在含LA的培养基上无明显生长抑制，培养皿上可观察到大量菌落生成。含LAC培养的培养基上的菌落数明显减少，表明与LA相比，同等剂量LAC对E. coli和S. aureus的抑菌性能明显增强，这主要得益于铜离子的引入增强了LA对细菌的金属毒性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F009图9LAC、LA的抑菌活性通过培养不同浓度LAC处理24 h后的E. coli和S. aureus菌液进一步研究菌液菌活力。MIC是细菌在相同试验条件下与空白生长对照相比，视觉能感知抑制细菌生长的最低浓度[24]。MBC是在相同试验条件下与空白生长对照相比，细菌生长减少99.9%[25]。E. coli和S. aureus菌落的MIC和MBC分析见图10。由图10可知，与对照组相比，0.25 g/L LAC处理后E. coli菌液菌落数显著降低；当处理浓度≥1.25 g/L后，菌液在固体培养基无E. coli菌落生成，表明LAC对E. coli的MIC和MBC分别为0.25、1.25 g/L。同理，抑菌结果表明LAC对S. aureus的MIC和MBC值分别为0.25、1.25 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F010图10E. coli和S. aureus菌落的MIC和MBC分析LAC的抑菌机理见图11。金属基材料具有良好的抑菌性能[26]。金属离子能够通过与生物分子中的官能团结合、交换酶中的中心金属或与硫醇基团结合等方式引起细菌代谢功能紊乱而死亡[27]。作为过渡金属的Cu可利用细菌代谢产物H2O2生成ROS，如羟基自由基（·OH）、超氧自由基（·O2-）、单线态氧（O2）和过氧化氢（H2O2）[7]。Nies[28]研究表明，当LAC的Cu2+发生还原反应生成Cu+。由Cu+继续发生类芬顿反应，产生过氧化氢和羟基自由基，通过氧化细菌细胞膜上蛋白质、糖、脂质，不可逆转地破坏细菌细胞膜。LAC碳链C12H23O2—有亲脂性，而细菌细胞膜是由磷脂双分子层组成，是LAC进入细菌细胞的重要途径[6]。随着细胞壁被破坏以及胞质内活跃的氧化反应的发生，LAC诱导产生的大量高氧化活性的ROS氧化胞内核酸，使DNA无法正常复制，从而抑制了细菌繁殖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.018.F011图11LAC的抑菌机理3结论本文以SL和CuSO4为原料，采用一步法合成制备LAC粉末。在此基础上，采用单因素试验和正交试验来确定最优制备LAC条件，即反应时间为60 min、合成温度58 ℃、pH值10、n（Cu2+）∶n（SL）为1.1∶2，以n（Cu2+）∶n（SL）对生产条件影响最大，合成温度次之，pH值最小。利用FTIR、XRD、TG、XPS对所得样品进行系统的分析，证实LAC的成功合成；利用SEM可以观察到，所得样品是棒状高度结晶的材料，平均尺寸约500 nm。在体外模拟胃环境中，LAC较CuSO4具有更优异的缓释性能。采用细菌总数测定法考察SL和LAC的抑菌性能，结果表明LAC较LA、SL有更明显的抑菌性能；LAC对E. coli和S. aureus的MIC和MBC值分别为0.25、1.25 g/L。