鱼粉是水产饲料最重要的饲料原料之一，但鱼粉资源短缺，需要寻找一种可替代鱼粉的优质蛋白源[1]。鸡肝粉是以新鲜的鸡肝为原料，经过蒸煮、搅碎、热风风干、低温瞬间制粉加工而成的动物性蛋白原料。鸡肝粉的加工过程极大地保留了原材料中的活性成分和浓郁的肝香味，可作为诱食剂应用于水产饲料中[2]。鸡肝粉的粗蛋白含量约65%，粗脂肪含量约10%，与鱼粉具有相似性。鸡肝粉是一种优质的动物小肽蛋白，能够部分替代鱼粉[3]。我国鸡肉产量高，鸡肝重约占肉鸡体重的2.3%[4]。因此，合理利用鸡肝粉这一优良的动物性蛋白源，有利于家禽资源的高效整合利用，还可在一定程度上解决水产饲料中的鱼粉短缺问题。凡纳滨对虾（Litopenaeaus vannamei）具有生长迅速、耐盐性广、抗病能力强、蛋白含量高等特点[5]。因此，本试验以凡纳滨对虾幼虾为对象，以生长性能、饲料利用、全体组成、消化、抗氧化和免疫能力为评价指标，研究鸡肝粉替代其饲料鱼粉的可行性，为凡纳滨对虾饲料产业的发展提供参考。1材料与方法1.1试验饲料试验以进口鱼粉、鸡肝粉、大豆浓缩蛋白、豆粕、花生粕和乌贼粉为蛋白源，鱼油、豆油和大豆卵磷脂为脂肪源，面粉为糖源和填充剂。上述饲料原料及预混料均由福州海马饲料有限公司提供。试验设计4组粗蛋白和脂肪水平分别约为46%和8%的等氮等脂饲料[6-7]，FM组、CLM20组、CLM40组、CLM80组分别使用鸡肝粉替代饲料中0、20%、40%、80%鱼粉。进口超级鱼粉中含有粗蛋白67.30%、粗脂肪6.68%；鸡肝粉中含有粗蛋白65.38%、粗脂肪10.1%。试验饲料组成及营养水平见表1。按照配方称取饲料原料，过80目筛网，采用逐级过大混匀的方法，将各个原料混匀后再与水混合，挤条，制成粒径为1.5 mm的颗粒饲料。饲料在90 ℃熟化30 min后，自然风干至约10%水分含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T001表1试验饲料组成及营养水平（干物质基础）项目FMCLM-20CLM-40CLM-80原料组成进口超级鱼粉30.0024.0018.006.00鸡肝粉06.1512.3024.65大豆浓缩蛋白15.0015.0015.0015.00豆粕15.0015.0015.0015.00花生粕10.0010.0010.0010.00乌贼粉5.005.005.005.00面粉12.0012.0712.1412.23鱼油2.001.891.781.56大豆油2.001.891.781.56大豆卵磷脂1.001.001.001.00维生素预混料2.502.502.502.50矿物质预混料2.002.002.002.00氯化钠1.501.501.501.50碳酸钙1.001.001.001.00磷酸二氢钙1.001.001.001.00合计100.00100.00100.00100.00营养水平水分11.4310.9411.6510.87粗蛋白45.3945.4845.7445.21粗脂肪7.717.387.497.73灰分9.799.229.849.38注：1.维生素预混料为每千克饲料提供：VB1 25 mg、VB2 45 mg、VB6 20 mg、VB12 10 mg、VC 1 000 mg、VK3 10 mg、肌醇800 mg、泛酸60 mg、烟酸200 mg、叶酸20 mg、碘酸钙60 mg、醋酸视黄酯32 mg、VD3 5 mg、α-生育酚240 mg。2.矿物质预混料为每千克饲料提供：硒20 mg、碘60 mg、钴50 mg、铜10 mg、铁80 mg、锌50 mg、锰45 mg、镁1 200 mg、一水磷酸钙10 000 mg、微晶纤维素8 485 mg。3.营养水平均为实测值。%1.2试验设计及饲养管理凡纳滨对虾购自福州海马饲料有限公司长乐养殖基地，暂养驯化2 w。随机选取360尾初始体重（1.20±0.10）g的幼虾随机4组，每3个桶为1个处理组，每桶30尾，共12个纤维桶（400 L）。试验期8 w，每天5：30、17：30各投喂1次，饱食投喂（投喂饲料后鱼不抢食，有少量剩余残饵视为饱食）。每天记录每个桶中对虾的生长情况。记录对虾的摄食行为以及水质情况。养殖系统中水温为25.5~27.5 ℃，pH值为7.5~7.7，溶氧量大于5 mg/L，氨氮含量小于0.15 mg/L。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验结束后对虾禁食24 h，统计各个桶中成活的对虾数量和总重，计算成活率（SR）、增重率（WG）、特定生长率（SGR）、饲料系数（FCR）和蛋白质效率（PER）。每个重复随机取3尾幼虾，分别测定体长、体重，解剖获取肝胰腺并称重，计算对虾的肥满度（CF）和肝胰腺指数（HSI）。WG=100%×(末重-初重)/初重(1)SGR=100%×(ln末重-ln初重)/试验天数(2)SR=100%×终末数量/初始数量(3)FCR=摄食量/(末重-初重)(4)PER=(末重-初重)/蛋白质摄入量(5)CF=100×体重/体长3 (6)HSI=100%×肝脏重/体重(7)1.3.2饲料和幼虾体成分每个重复取3尾幼虾，于-20 ℃保存。参照AOAC[8]的方法测定饲料和幼虾的全体成分。采用105 ℃常压干燥法用烘箱测定水分含量，使用Kjeltec 8400型凯氏定氮仪测定粗蛋白质含量，使用索氏抽提仪测定粗脂肪含量，使用马弗炉在550 ℃下测定灰分含量。1.3.3消化、抗氧化和免疫相关酶活性每个重复取6尾虾，于倒数第三步足基部抽取血淋巴，4 ℃过夜，2 500 r/min离心10 min（4 ℃），取上清液于-80 ℃冰箱保存。每桶取9尾幼虾的肠道保存于-80 ℃冰箱，用于测定消化酶活。称取肠道样品以重量体积比为1∶9在冰上与生理盐水混合，匀浆，4 ℃、2 500 r/min离心10 min，获得上清液。使用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定肠道淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶活性，血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）的含量等抗氧化指标，血清碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、酚氧化酶（PO）和溶菌酶（LZM）等免疫相关指标。上述指标均按照说明书测定。1.3.4总RNA提取和实时荧光定量PCR（qPCR）取3尾幼虾的肝胰腺保存于-80 ℃冰箱，用于测定免疫相关基因的表达量。qPCR试验所用试剂和试剂盒均购自翌圣生物科技有限公司，采用RNA提取试剂盒提取肝胰腺样品的总RNA，经过1.2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定的高质量RNA，再通过分光光度法（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific）测定RNA浓度，取1 000 ng RNA，使用反转录试剂盒Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR合成cDNA。试验中目的基因的特异性引物均采用Primer Premier 5.0 软件设计，引物序列见表2，β-actin作为内参基因。将0.8 μL cDNA模板、0.4 μL正反向引物、8.4 μL DEPC水和10 μL 2×SYBR Green Master混合均匀，在Lightcycler 96（Roche，Switzerland）仪器上机，程序设置为95 °C 2 min、95 °C 10 s、58 °C 10 s、72°C 20 s的45个循环。目的基因的相对表达水平将采用2-ΔΔCT法计算[9]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T002表2引物序列基因引物序列（5'→3'）基因序列号长度/bpβ-actinF-CCACGAGACCACCTACAACR-AGCGAGGGCAGTGATTTCAF300705142酸性磷酸酶（ACP）F-GAGGAGGTTCAGAGAGGAR-CAGATAAGGCACATAGGCKR676449138抗脂多糖因子（ALF）F-CGCTTCACCGTCAAACCTTACR-GCCACCGCTTAGCATCTTGTTGQ227486.1196碱性磷酸酶（AKP）F-AAAGGCACTGGGAAAATGR-CCTCCACCAAGGATGACCKR534873127免疫缺陷因子（IMD）F-CGGCTCTGCGGTTCACATR-CCTCGACCTTGTCTCGTTCCTFJ592176.1271溶菌酶-α（LZM）F-TGTTCCGATCTGATGTCCR-GCTGTTGTAAGCCACCCAY170126.2123酚氧化酶（PO）F-GCCTTGGCAACGCTTTCAR-CGCGCATCAGTTCAGTTTGTEF115296.1681.4数据统计与分析采用SPSS 22软件中对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾生长性能和形态参数的影响（见表3）由表3可知，CLM20组幼虾的WG、SGR、PER显著高于CLM80组（P0.05），FCR显著低于CLM80组（P0.05）。CLM40组幼虾的PER显著低于CLM20组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T003表3鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾生长性能和形态参数的影响组别初重/g末重/gWG/%SGR/(%/d)SR/%FCRPERCF/(g/cm3)HSI/%FM1.12±0.089.57±1.22749.58±50.85a3.82±0.11a88.89±5.091.01±0.05b2.18±0.10ab0.63±0.074.86±0.47CLM201.22±0.1010.07±1.22727.55±24.63a3.77±0.05a91.11±3.850.94±0.08b2.36±0.20a0.58±0.065.23±0.42CLM401.23±0.089.66±0.96686.78±26.79ab3.68±0.06ab87.78±8.391.14±0.15ab1.93±0.25bc0.60±0.045.11±0.36CLM801.23±0.169.27±1.38651.40±18.73b3.60±0.04b88.89±1.921.29±0.13a1.72±0.16c0.63±0.065.06±0.28注：同列数据肩标不同字母表示显著差异（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾体成分的影响（见表4）由表4可知，幼虾中粗蛋白和粗脂肪含量随鸡肝粉替代鱼粉水平增加均呈先上升后下降的趋势，其中CLM20组幼虾粗蛋白含量显著高于FM组和CLM80组（P0.05），粗脂肪含量显著高于CLM80组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T004表4鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾体成分的影响组别水分粗蛋白粗脂肪灰分FM74.12±3.4171.66±1.23b8.18±0.53ab12.51±1.22CLM2073.27±2.8974.14±0.75a8.61±0.36a12.96±0.11CLM4076.22±4.1472.13±1.22ab8.13±0.32ab12.46±1.06CLM8074.45±3.3970.78±1.43b7.72±0.47b11.57±1.04%2.3鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾肠道消化酶活性的影响（见表5）由表5可知，CLM20组幼虾的蛋白酶活性显著高于CLM80组（P0.05）。CLM80组幼虾的脂肪酶显著低于FM组和CLM20组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T005表5鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾肠道消化酶活性的影响组别蛋白酶/(U/mg prot)脂肪酶/(U/g prot)淀粉酶/(U/g prot)FM315.29±21.32ab5.35±0.72a74.06±8.34CLM20356.52±17.84a5.20±0.59a69.55±8.34CLM40321.15±28.77ab4.71±1.22ab72.55±2.31CLM80264.34±21.65b3.88±0.31b77.17±9.472.4鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾血清抗氧化能力的影响（见表6）由表6可知，CLM20组和CLM80组对虾血清SOD活性显著高于FM组（P0.05）。CLM20组对虾血清GSH-Px活性显著高于FM组和CLM80组（P0.05）。CLM80组对虾血清MDA含量显著低于CLM20组和CLM40组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T006表6鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾血清抗氧化能力的影响组别CAT/(U/mL)SOD/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)MDA/(μmol/L)FM8.57±0.6538.27±1.29c21.33±2.04b15.70±1.67abCLM207.14±1.1146.87±0.61b24.80±1.15a11.43±3.75bCLM408.06±1.0058.37±2.41a22.85±1.31ab12.61±1.43bCLM806.52±1.7348.08±1.71b20.58±1.80b18.23±1.08a2.5鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾血清免疫相关酶活性的影响（见表7）由表7可知，CLM20组对虾血清中LZM活性最高，显著高于其他各组（P0.05）。对虾幼虾血清ACP、AKP、PO的活性均随鸡肝粉替代鱼粉水平升高呈先升高后降低的趋势，分别以CLM40组、CLM20组和CLM20组最高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.T007表7鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾血清免疫相关酶活性的影响组别ACP/(U/L)AKP/(U/L)LZM/(U/mL)PO/(U/mL)FM51.92±4.90bc27.93±2.42a62.56±3.00b34.93±3.19cCLM2055.15±3.17b29.23±3.14a69.69±4.93a47.86±0.79aCLM4066.89±4.84a27.34±2.64a59.43±2.45b38.64±2.96bcCLM8045.51±4.19c21.74±3.33b57.51±1.61b40.45±2.44b2.6鸡肝粉替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺免疫相关基因的影响（见图1）由图1可知，对虾肝胰腺中ACP、ALF、LZM和PO的表达量随饲料中鸡肝粉含量增加而呈先升高后降低的趋势，其中ACP、LZM和PO的表达量分别在CLM20组、CLM20组和CLM40组达到最高。CLM80组对虾肝胰腺LZM表达量显著高于FM组（P0.05）。CLM20组和CLM40组对虾肝胰腺ALF的表达量均显著高于FM组与CLM80组（P0.05），FM组的表达量最低（P0.05）。CLM20组对虾肝胰腺的IMD表达量显著高于CLM40组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.011.F001图1鸡肝粉替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺免疫相关基因的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）。3讨论3.1鸡肝粉部分替代鱼粉水平对凡纳滨对虾生长性能和形态参数的影响研究表明，羽扇豆粉能够替代幼虾（初重约3.61 g）饲料中40%的鱼粉而不影响凡纳滨对虾的生长性能[10]，其中对照组饲料的鱼粉含量为25%。乙醇梭菌蛋白能够成功替代30%的鱼粉（基础饲料含56%鱼粉）而不影响幼虾（初重2.78 g）的生长性能和肌肉品质[11]。黍粉、玉米蛋白粉和豆粕混合蛋白在鸡肉粉不变的情况下，能够替代对虾（初重约0.03 g）饲料中100%的鱼粉，其中基础组鱼粉含量为9%。与植物蛋白源相比，动物蛋白源替代凡纳滨对虾饲料鱼粉的研究相对较少[12]。研究发现，磷虾粉完全替代饲料鱼粉，对凡纳滨对虾幼虾（4.08 g）的生长性能无负面影响，基础饲料中的鱼粉含量为25%[13]。肉骨粉能够替代25%的鱼粉（基础饲料的鱼粉含量为45.4%），当替代水平达到50%时，凡纳滨对虾（初重5.00 g）的生长性能显著下降[14]。当基础饲料中鱼粉含量为55.6%时，鸡肉粉最高能够替代50%的鱼粉而不影响凡纳滨对虾幼虾（167 mg）的SGR[15]。鸡肉粉∶磷虾粉∶玉米蛋白粉（1∶1∶1）的混合蛋白能够替代100%的鱼粉（基础料含鱼粉38%），凡纳滨对虾幼虾（2.55 g）的生长性能不受替代鱼粉水平的影响[16]。以上研究表明，凡纳滨对虾对不同蛋白源均有一定的接受度。本试验中，当使用鸡肝粉替代40%以上的鱼粉时，幼虾（初重1.20 g）WG和SGR显著下降，说明鸡肝粉最多能够替代40%的鱼粉。本试验发现，在鸡肝粉替40%鱼粉时，对虾的FCR显著升高，在鸡肝粉替代超过20%时，对虾的PER显著降低，可能是因为鸡肝粉营养价值高且诱食性强[2,17-18]，因此鸡肝粉低比例替代饲料鱼粉不影响凡纳滨对虾幼虾的饲料利用。研究发现，鸡肝和猪肝水解混合物替代25%的鱼粉能够使凡纳滨对虾（初重8.69  g）获得更高的WG和更低的FCR，替代水平高于50%时，对虾的生长性能将显著降低[3]。在基础饲料含20%鱼粉，替代组补充晶体蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸达到氨基酸平衡的情况下，鸡肝粉能够替代80%的饲料鱼粉而不影响凡纳滨对虾（初重0.54 g）的生长性能和饲料利用率，而且替代水平为22.81%时，幼虾的WG显著高于对照组，FCR显著低于对照组[18]，与本试验结果不完全相同。可能是由于对虾的个体大小、饲料原料、加工方式、基础饲料的鱼粉含量、养殖环境等因素造成。3.2鸡肝粉替代部分鱼粉对凡纳滨对虾体成分与消化能力的影响本试验中，FM组、CLM20组和CLM40组对虾肠道蛋白酶和脂肪酶活性差异不显著，但是CLM20组虾肠道蛋白酶和脂肪酶活性显著高于CLM80组。研究表明，与单一的蛋白源和脂肪源相比，混合的来源在水产动物饲料中的优势更大，因为不同来源的氨基酸和脂肪酸能够组成更加平衡的营养成分，更利于消化和吸收[16,19-20]；而高比例的替代将导致饲料中必需氨基酸（如赖氨酸和蛋氨酸）和脂肪酸（DHA和EPA）含量的降低[21]，影响养殖动物对营养物质的消化吸收。这可能是本试验中鸡肝粉低比例替代鱼粉不影响肠道蛋白酶和脂肪酶活性的原因之一。本试验发现，CLM20组幼虾全体的粗蛋白含量显著高于FM组和CLM80组，粗脂肪含量显著高于CLM80组，与蛋白酶和脂肪酶的变化趋势相似。这可能是因为消化酶活性的增强往往伴随着对养殖动物对相应营养物质消化率的提高[22-23]，营养物质经过代谢并最终沉积到机体中。研究发现，鸡肉粉替代20%的鱼粉能够显著增加凡纳滨对虾幼虾全体粗蛋白的含量和蛋白酶活性[18]，与本试验结果不完全一致。可能是本研究未补充晶体氨基酸，有待进一步研究。3.3鸡肝粉替代部分鱼粉对凡纳滨对虾抗氧化能力的影响机体代谢过程中可产生一些活性氧（ROS），ROS过多积累会导致氧化应激[24]。ROS在分解过氧化氢时会产生MDA和其他脂质过氧化物的积累。MDA是反映机体氧化应激水平的标志物之一[25]。CAT、GSH-Px和SOD是酶促抗氧化防御系统的基本成分，可用于清除机体内过多的ROS，CAT的主要功能是将H2O2分解成H2O和O2，GSH-Px则催化谷胱甘肽过氧化氢转化为H2O，而SOD将超氧自由基（·O2-）转化为H2O2[26]。本研究中，CLM20组和CLM40组凡纳滨对虾血清中MDA含量显著低于CLM80组，CLM组凡纳滨对虾血清SOD活性显著高于FM组，CLM20组的GSH-Px活性显著高于FM组，与前人的研究结果一致[18]。研究发现，鸡肝水解物能够提高小鼠肝脏中抗氧化相关酶的活性[27-28]，可能是鸡肝中含有丰富的牛磺酸导致[17,29]。因此，鸡肝粉替代20%~40%的鱼粉能够提升凡纳滨对虾的抗氧化能力。3.4鸡肝粉替代部分鱼粉对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响凡纳滨对虾等甲壳动物主要靠非特异性免疫系统抵抗病原体的侵害[30]，这种系统主要由吞噬细胞、蛋白酶、LZM和PO等多种成分组成。其中LZM是具有对抗多种病原体入侵作用的天然拮抗剂，可在病原体溶解过程中发挥重要作用[18]；PO是反映无脊椎动物免疫状态的敏感指标，起到识别病原并参与防御的作用[31]；AKP参与了消化和解毒过程，ACP在遇到组织或细胞损伤时由溶酶体释放，血清中AKP和AKP活性的增强有助于提高水产动物免疫系统[32-34]。IMD是IMD信号通路中的核心元件，该通路在抵御病毒和革兰氏阴性菌的感染中发挥重要作用[35]；ALF是对虾体内三类主要抗菌肽物质之一[36]。本试验中，凡纳滨对虾血清中ACP、AKP、LZM和PO的活性随饲料中鸡肝粉含量增加而呈先上升后下降的趋势，并在CLM20组或CLM40组达到最高，这与肝胰腺中的ACP、ALF、IMD、LZM和PO的表达量变化趋势相似，与何树青[18]研究结果相似。此外，体外研究发现，鸡肝水解物具有较好的抗菌活性[37]。综上，可进一步说明鸡肝粉替代20%~40%的饲料鱼粉有助于提高凡纳滨对虾幼虾的非特异性免疫能力。4结论本试验结果表明，饲料中添加适宜的鸡肝粉能够提高凡纳滨对虾的消化酶、抗氧化酶、免疫相关酶活性及基因的表达水平。以生长性能为评价指标，鸡肝粉最多能够替代40%的鱼粉在凡尔滨对虾中应用。