当环境温度高于25 ℃或温湿度指数（THI）大于72时，可引起奶牛产生热应激[1-2]。在夏季高温高湿的环境中，奶牛体内热量散失速率会受到阻碍，加重奶牛热应激程度，促使免疫功能下降，产生氧化应激[3]。热应激会使牦牛产奶量、繁殖性能下降，增加牦牛患病的概率[4]。奶牛处于热应激的情况的采食量会降低，导致奶牛处于能量负平衡状态，造成奶牛血清中血糖、蛋白质以及其他碳水化合物含量降低[5]。动物为适应热应激，会激活不同的代谢机制，若热应激对动物的刺激超出动物机体的调节范围，会引起动物应激反应，造成动物生长性能和免疫功能下降[6]。研究发现，热应激状态下，放牧西门塔尔母牛血清免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）含量极显著下降[7]。热应激还可导致奶牛血清抗氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低，氧化应激终产物丙二醛（MDA）含量显著升高，促进炎症因子分泌，加剧奶牛氧化应激和炎症反应[8]。氧化应激产生过量的活性氧（ROS），对脂质蛋白质等生物大分子造成损伤。脂质氧化的前提物质是多不饱和脂肪酸（PUFA），PUFA被氧化后对动物的免疫功能产生负面影响[9]。内蒙古地区夏季高温，易造成动物产生热应激反应。目前关于反刍动物热应激的研究多集中于奶牛、羊等，而对肉牛热应激的研究鲜有报道。因此，本研究在夏季选取西门塔尔母牛进行热应激试验，探究慢性热应激对舍饲西门塔尔母牛免疫功能和抗氧化能力的影响，为夏季舍饲肉牛相关研究提供参考。1材料与方法1.1试验设计与饲养管理试验在内蒙古自治区兴安盟乌兰浩特市科尔沁右前旗归流河林富畜禽养殖专业合作社进行。试验分为两个阶段，分别为非应激期（2021年9月18日—9月27日）和热应激期（2021年7月29日—8月7日）。选取10头4岁体况、体重相近的健康西门塔尔母牛，采取散栏饲养的方式，每天早晚共饲喂两次。日粮由牛场统一调配（采用全混合日粮），试验牛自由采食、饮水。日粮原料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.001.T001表1日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米青贮38.50代谢能/(MJ/kg)10.93干草11.50粗蛋白/%11.70玉米22.15干物质/%86.13豆粕12.59粗灰分/%12.83麸皮13.76酸性洗涤纤维/%29.61预混料1.00中性洗涤纤维/%41.09食盐0.50注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 64 000 IU、VD3 19 150 IU、VE 80.00 IU、Cu 11.36 mg、Fe 45.00mg、Mn 24.20 mg、Zn 33.00 mg、Se 0.28 mg、Co 0.10 mg、I 0.33 mg。2.营养水平中代谢能是计算值，其余均为实测值。1.2环境温湿度测定在距牛舍地面1.5 m处悬挂温湿度计，于试验期内每天8：00、14：00、20：00记录牛舍温度和湿度，计算THI并根据THI判定西门塔尔母牛处于何种状态。THI=(1.8×Td+32)-(0.55-0.55×RH×0.01)×(1.8×Td-26)(1)式中：Td为干球温度（℃）；RH为相对湿度（%）。1.3样品采集分别在热应激期和非应激期的最后1 d清晨，对试验牛进行空腹尾静脉采血。用非抗凝采血管采集10 mL血液，静止0.5 h，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液分装至1.5 mL离心管中，将分离出的血清放入液氮罐中保存，带回实验室于-80 ℃冰箱中保存。1.4测定指标及方法1.4.1免疫指标采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定IgA、IgG、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。1.4.2抗氧化指标利用GYI-LRH-400-D生化培养箱测定过氧化氢酶（CAT）、GSH-Px、SOD、总抗氧化能力（T-AOC）、MDA水平。1.4.3血清生化指标使用BIO-RAD680型酶标仪检测葡萄糖（GLU）、胰岛素（INS）、非酯化脂肪酸（NEFA）、生长激素（GH）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平。所需ELISA试剂盒全部购自上海宝曼生物科技有限公司，检测过程严格按照试剂盒说明书进行。1.5数据统计与分析数据采用Excel 2019软件进行初步处理，SPSS 19.0进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1牛舍环境温度、湿度及温湿指数测定结果（见表2）由表2可知，非应激期环境温度最高为18.00 ℃，最低为12.67 ℃，平均值为15.40 ℃；THI最高为61.19，最低为55.16，平均值为59.36。热应激期环境温度最高为34.00 ℃，最低为20.00 ℃，平均值为26.83 ℃；THI最高为82.13，最低为66.30，平均值为73.66。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.001.T002表2牛舍的环境温度湿度及温湿指数测定结果项目非应激期热应激期温度/℃最低值12.6720.00最高值18.0034.00平均值15.4026.83相对湿度/%最低值53.0030.00最高值94.6791.00平均值71.4346.03THI最低值55.1666.30最高值61.1982.13平均值59.3673.662.2热应激对舍饲西门塔尔母牛免疫指标的影响（见表3）由表3可知，与非应激期相比，热应激期舍饲西门塔尔母牛血清中IgA、IgG、IgM、IL-2的含量均显著降低（P0.05），血清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.001.T003表3热应激对舍饲西门塔尔母牛免疫指标的影响项目IgA/(mg/L)IgG/(mg/L)IgM/(mg/L)IL-1β/(ng/L)IL-2/(ng/L)IL-4/(ng/L)IL-6/(ng/L)TNF-α/(ng/L)P值0.0080.0070.0090.0040.0070.1910.0040.003非应激期363.33±87.39a416.91±31.43a268.06±49.20a345.91±48.54b1 064.50±106.59a99.20±14.95174.36±17.52b137.06±8.86b热应激期270.61±46.07b369.73±38.21b211.41±35.54b426.82±62.02a853.00±192.60b90.11±15.01211.33±31.22a172.84±31.17a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。2.3热应激对舍饲西门塔尔母牛抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与非应激期相比，热应激期舍饲西门塔尔母牛血清CAT、GSH-Px、SOD活性以及T-AOC显著降低（P0.05），MDA含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.001.T004表4热应激对舍饲西门塔尔母牛抗氧化指标的影响项目CAT/(U/mL)GSH-Px/(U/L)SOD/(U/mL)T-AOC/(U/mL)MDA/(μmol/L)P值0.0110.0420.0120.0210.036非应激期97.85±4.51a545.19±59.27a251.79±31.50a20.44±3.59a8.93±1.22b热应激期86.17±12.23b457.60±111.82b211.74±32.25b16.17±3.94b11.95±4.04a2.4热应激对舍饲西门塔尔母牛血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，与非应激期相比，热应激期舍饲西门塔尔母牛血清INS含量显著升高（P0.05），GLU、NEFA、GH、IGF-1含量均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.001.T005表5热应激对舍饲西门塔尔母牛血清生化指标的影响项目GLU/(mmol/L)INS/(mIU/L)NEFA/(μmol/L)GH/(μg/L)IGF-1/(μg/L)P值0.0420.0250.2490.0120.002非应激期9.24±2.69a22.45±2.65b2 033.50±273.23a18.43±1.38a309.62±14.02a热应激期7.06±1.62b25.77±3.37a1 896.00±242.45b15.80±2.61b275.38±27.39b3讨论3.1温湿度对西门塔尔母牛的影响西门塔尔母牛在5~25 ℃温度范围内生长速度最快、生产性能最佳、环境温度的不良影响最小，环境温度超出西门塔尔母牛所能承受的上限，使牛遭受热应激程度加重[10]。热应激对动物的不良影响与温度成正比，当环境温度为25 ℃时，动物的采食量（DMI）会发生明显的变化；环境温度上升至32 ℃时，动物DMI下降5%，导致动物出现能量负平衡，造成动物生长缓慢和体重减轻；环境温度进一步上升后，动物直肠温度超出正常温度范围3~6 ℃时，会因温度过高而死亡[11]。Mishra[12]研究发现，与非应激20 ℃相比，犊牛热应激30 ℃时DMI降低9%。热应激对牛影响严重程度还可用THI表示。THI72时为非应激；73≤THI≤77时为轻度热应激；78≤THI≤89时为中度热应激；THI≥90时为重度热应激[12]。奶牛在遭受3 d的76.4≤THI≤78热应激时，DMI降低14.6%，热应激也会导致饲料转化率降低[12]。黄德均等[13]研究表明，THI≤72时，牛无热应激；72THI≤79时，牛处于轻度热应激；79THI≤88时，牛处于中度热应激；THI88时，牛处于重度热应激。肉牛散热性能不发达易受到热应激的不良影响，可通过降低DMI减少机体产热维持肉牛正常体温[5]。本试验中，秋季舍饲西门塔尔母牛未产生热应激，夏季舍饲西门塔尔母牛产生热应激。3.2热应激对西门塔尔母牛免疫功能的影响抗原入侵动物机体后，机体会产生免疫球蛋白清除抗原，IgA、IgG、IgM在机体特异性免疫中具有重要作用[14]。IgA、IgG、IgM的含量受到动物品种、动物的体况、应激持续时间的长短以及强度的影响[15]。热应激会改变牛的免疫功能，遭受热应激的犊牛血清中IgG、IL-6、B淋巴细胞含量降低，机体清除微生物病原体的能力降低。热应激还可降低犊牛从初乳中摄取免疫球蛋白的能力，对牛免疫功能造成的不良影响[16]。李川等[17]对比热应激与非应激动物血清免疫球蛋白含量，发现热应激状态下动物IgA、IgG、IgM的含量分别下降19.60%、48.60%、17.71%，表明热应激会造成动物免疫功能降低。热应激可诱发炎症反应，使动物出现中暑现象，严重时甚至威胁动物生命。小鼠遭受热应激后炎症标志物IL-1β和TNF-α含量升高。应激类型和强度不同，对促炎和抗炎系统影响也不同，急性应激增强免疫功能，慢性应激抑制免疫功能；应激强度过大时，机体内促炎和抗炎系统失衡，导致炎症反应强度增加[18]。TNF-α由单核细胞和巨噬细胞分泌，在动物机体发生炎症早期被大量释放，是机体炎症反应中最主要的细胞因子，动物体内TNF-α含量可作为判断是否发生炎症反应的依据，IL-6由B细胞分泌，在多种炎症反应中出现异常表达[19]。Yang等[20]研究表明，IL-1β和IL-6是促炎细胞因子，少量分泌可加强动物免疫能力，降低应激对动物造成的损伤；IL-1β和IL-6大量分泌会对动物组织造成损伤，使机体免疫功能降低。动物机体内IL-2含量由T淋巴细胞产生，是一种多效的细胞因子，能够间接反映动物免疫功能是否正常，在动物的病理和生理中发挥广泛作用[21]。陈浩等[22]研究发现，夏季慢性热应激会造成西门塔尔母牛血清IL-2含量显著降低。韩爱云等[23]发现，急性热应激造成畜禽血清中IL-2含量显著升高，表明动物血清IL-2含量受热应激持续时间影响，急性热应激可能会加强动物的免疫功能，慢性热应激则会降低动物免疫功能。肉牛血清IL-4含量也会受到热应激的影响。胡煜等[24]发现，肉牛遭受慢性热应激后，血清IL-4含量无显著变化。本研究中，慢性热应激使西门塔尔母牛血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高，IgA、IgG、IgM、IL-2含量显著降低，表明热应激导致西门塔尔母牛免疫功能降低，甚至引起机体内炎症反应。3.3热应激对西门塔尔母牛抗氧化能力的影响动物体内ROS大量积累，机体氧化和抗氧化平衡被打破，导致动物细胞出现氧化损伤，严重时甚至造成细胞凋亡。PUFA的氧化产物是MDA，其含量与ROS成正比，可用MDA含量判断动物是否遭受氧化应激[25]。MDA含量与CAT活性、T-AOC成反比[26]。动物机体代谢功能紊乱，抗氧化平衡被打破时，机体会消耗大量抗氧化酶以清除过量ROS。细胞内抗氧化系统主要由SOD、GSH-Px、CAT协同作用，清除动物机体内ROS，阻止脂质过氧化。T-AOC可表示动物在应激期间的抗氧化状态，血清T-AOC降低，表明ROS含量增加，动物机体的抗氧化能力降低，细胞受到损伤，代谢途径发生紊乱[27]。Kochman等[28]指出，T-AOC反映机体抗氧化应激能力大小，SOD可清除ROS，CAT在H2O2转化为水和氧气过程中起到关键作用，GSH-Px亦可对H2O2起到清除的作用。大鼠体内产生氧化应激时，CAT可清除过量H2O2，造成CAT含量降低[29]。张灿等[30]研究表明，山羊遭受慢性热应激后，血清中抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性显著下降，MDA含量显著增加。王玲等[31]比较夏季和秋季肉牛血清中抗氧化指标，发现夏季遭受热应激肉牛血清中SOD、GSH-Px的活性及T-AOC显著降低。白丹丹等[32]比较季节变化对三河牛的影响，发现夏季热应激使三河牛血清中SOD、GSH-Px的活性及T-AOC显著低于春季无应激。夏季奶牛遭受热应激后，血清SOD活性、T-AOC显著降低[33]。殷斌[34]对牛细胞培养液进行1~3 h热应激，结果表明，心肌细胞内SOD活性持续下降，5 h后心肌细胞内SOD活性与3 h相比出现增加的趋势，SOD活性仍低于无应激的细胞。蔡明成[35]研究发现，热应激状态下肉牛血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC显著下降。本试验结果表明，热应激状态下，西门塔尔母牛血清中SOD、GSH-Px、CAT活性及T-AOC显著降低，导致西门塔尔母牛抗氧化能力受到抑制。3.4热应激对舍饲西门塔尔母牛血清生化指标的影响血清代谢物可用于判定动物机体组织生理功能变化。研究发现，热应激会影响奶牛的NEFA、GLU、INS、TG代谢，奶牛血清GLU含量降低，主要是由奶牛DMI下降引起[36]。GLU通过能量转化或氧化释放的方式为动物提供能量，调节机体生命活动，由胰岛B细胞分泌的INS是调节GLU转化、合成的蛋白质激素[37]。Scharf等[38]研究发现，热应激条件下肉牛血清GLU含量会随着环境温度升高而降低。陈浩等[22]研究表明，在热应激条件下，放牧西门塔尔牛血清中GLU含量降低。动物遭受热应激后体温升高，动物机体为适应高温环境会降低脂肪氧化减少产热，但这会造成NEFA浓度降低。王哲奇[39]研究表明，热应激状态下动物血清中NEFA含量下降。Gao等[40]研究发现，热应激条件下奶牛血清NEFA含量降低。本试验发现，与非应激相比，慢性热应激期舍饲西门塔尔母血清INS含量显著升高，GLU含量显著降低，NEFA含量有所降低，但差异不显著，使动物供能减少，降低代谢产热。牛在热应激状态下会分泌不同的激素进入体循环，达到调节机体代谢的作用，与调节机体热应激有关的神经内分泌激素包括GH、IGF-1等。GH促进动物机体组织生长，加强机体脂肪和蛋白质的分解，IGF-1作用与GH相似，可对细胞生长起促进的作用。IGF可以介导GH的促生长作用，GH使肝脏分泌和合成IGF-1，IGF-1刺激不同靶细胞的分化与生长[41]。研究表明，热应激状态下蒙古牛血清GH含量降低[42]。贾鼎锌等[10]研究表明，在热应激状态下，肉牛DMI降低，血清GH、IGF-I含量降低。动物血液中IGF-I的含量因热应激而降低，可能与GH-IGF轴的存在有关。热应激会降低GH的含量，低含量的GH无法激活肝脏GH-IGF轴，减少肝脏分泌IGF-I[12]。本试验结果表明，与非应激相比，热应激状态下舍饲西门塔尔母牛血清中GH、IGF-1含量显著降低，造成糖异生，降低脂肪分解作用，使西门塔尔母牛生长发育缓慢。4结论慢性热应激会造成西门塔尔母牛机体中ROS大量积累。为清除ROS，机体内的抗氧化物质被大量消耗。长时间的热应激会造成免疫球蛋白的含量显著降低，炎症因子生物含量显著升高，破坏西门塔尔母牛的免疫功能、抗氧化能力以及炎症反应之间的协同作用。