热应激已成为影响禽类生长发育和肠道健康的主要问题[1]。小肠是机体重要的消化器官。在热应激条件下，动物的采食量会减少，改变肠道消化酶和营养转运因子的表达，进而影响动物的增重[2]。此外，热应激可导致肠道微生物群紊乱，抑制肠道消化，造成严重的生理功能障碍[3]。因此，寻找保护禽类肠道健康的解决方法迫在眉睫。锌是人和动物机体必不可少的矿物营养元素，具有蛋白质的调节、DNA代谢、免疫和抗氧化防御等生物学功能[4-5]。研究表明，在热应激条件下补锌可提高动物的生产性能，改善肠道形态，维持肠道屏障功能[6-8]。目前，日粮中锌的添加形式主要分为无机锌和有机锌。无机锌主要以氧化锌和硫酸锌为代表的不含碳的化合物，具有生物利用率低、添加量大的缺点；有机锌是含碳且具有碳氢键的化合物，生物利用率较高，可在降低锌添加量的同时更好地促进禽类生长发育[9]。抗坏血酸锌（AsA-Zn）是新型有机锌源，具有提高超氧化物歧化酶活性和抑菌效果，可促进脂肪合成和用于治疗糖尿病[10-12]。AsA-Zn还可提高罗非鱼生长性能和抗氧化能力[13]。基于有机锌源AsA-Zn在热应激禽类肠道健康方面的研究较少，同时不同形式锌源间在热应激禽类肠道方面的研究也较少。本试验在马岗鹅基础日粮中额外添加60 mg/kg的无机氧化锌（ZnO）和有机AsA-Zn，研究其对热应激状态下马岗鹅小肠形态和盲肠微生物群的影响，为AsA-Zn在热应激鹅肠道健康中提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用ZnO为饲料级（纯度99%）；AsA-Zn参考文献[14]实验室自制，锌含量为14.38%。1.2试验设计与饲养管理马岗鹅由清远市金业家禽种苗繁育有限公司提供。选取14日龄、体重相近的马岗鹅180只，随机分为3组，每组6个重复，每个重复10只鹅（公、母各半）。对照组（CON组）鹅饲喂基础日粮、各试验组分别在基础日粮中额外补充60 mg/kg的ZnO和AsA-Zn（以锌含量计），即ZnO 60组和AsA-Zn 60组。试验期35 d，其中预试期7 d（14~20日龄），马岗鹅饲喂基础日粮，正式试验期28 d（21~48日龄）。基础日粮按照NRC（1994）标准和文献[15]配制，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.T001表1基础日粮组成和营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米62.88粗蛋白质/%15.42豆粕17.07粗脂肪/%24.93麦麸14.96粗灰分/%5.85磷酸氢钙1.79水分/%10.33石灰石1.05锌/(mg/kg)41.32沸石粉1.03粗纤维/%4.80预混料0.68钙/%1.20食盐0.34总磷/%0.59蛋氨酸0.10赖氨酸/%0.85苏氨酸0.10代谢能/(MJ/kg)12.16注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 5 000 IU、VB1 5.0 mg、VB2 8 mg、VB6 5.0 mg、VB12 12 μg、VD3 800 IU、VE 50 IU、VK3 2.5 mg、叶酸0.5 mg、生物素0.3 mg、烟酰胺40 mg、泛酸25 mg、胆碱1 500 mg、铁85.2 mg、铜10 mg、碘0.3 mg、硒0.25 mg。2.营养水平中代谢能、粗纤维、钙、总磷和赖氨酸为计算值，其余均为实测值。试验在广东省汕尾市绿丰源现代农业发展有限公司进行。试验全程采用高床旱养模式，室内平均温度维持在（33±2）℃。试验期间马岗鹅自由进食和饮水，并按照公司的免疫程序进行免疫接种。1.3测定指标及方法试验结束时，每个重复选取体重相近的马岗鹅1只，分离肠段后，剪取1 cm3十二指肠、空肠和回肠放入4%的甲醛固定液中，用于组织切片的制作；并将盲肠内容物取出1 g放入无菌的冻存管后，置于液氮中保存用于微生物16S RNA测序。1.3.1小肠组织形态使用正置白光拍照显微镜（Nikon，EclipsE Ci-L）在40倍下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0测量绒毛高度（VH）和隐窝深度（CD），每张切片测量5个数据，计算绒毛高度/隐窝深度（V/C）。1.3.2盲肠微生物群1.3.2.1DNA抽提与检测和PCR扩增通过CTAB法对采集的样品进行总DNA的提取，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。选择16S RNA的V3-V4区进行测序分析其微生物，并在上游引物为（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和下游引物为（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）进行PCR扩增。1.3.2.2文库的构建和测序文库构建使用DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒（Illumina公司），并通过Qubit定量和文库对构建好的文库进行检测。由深圳微科盟科技集团有限公司使用NovaSeq-6 000PE-250（Illumina公司）上机测序。1.3.2.3生物信息分析本研究使用DADA2方法对原始测学进行去噪去嵌合，得到准确的特征序列。使用韦恩图分析各组间共有和特有Uparse聚类生成操作分类单元（OTUs）。从门水平上对各组的组成和相对丰度进行分析，采用线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）方法探究各组属水平上的菌群丰度差异，使用软件Qiime2 diversity完成各组的Alpha多样性的分析，Beta多样性通过R语言MixOmics包进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。通过KEGG数据库对微生物功能相关通路进行预测，并利用ANOVA+Duncan's法和Dunn test对各组间的显著性差异进行分析。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。使用Origin 2021软件绘制图像。2结果与分析2.1不同锌源对热应激马岗鹅小肠形态的影响（见表2）由表2可知，与CON组相比，日粮中添加ZnO和AsA-Zn可显著提高马岗鹅空肠和回肠的VH值（P0.05），其中AsA-Zn更具优势。AsA-Zn 60组马岗鹅空肠CD值显著高于CON组（P0.05）。日粮中添加ZnO和AsA-Zn显著提高马岗鹅十二指肠、空肠和回肠的V/C（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.T002表2不同锌源对热应激马岗鹅小肠形态的影响项目CON组ZnO 60组AsA-Zn 60组P值十二指肠VH/mm0.59±0.030.72±0.040.66±0.030.409CD/mm0.19±0.020.19±0.060.18±0.050.997V/C3.19±0.20b4.17±0.46a3.96±0.42a0.026空肠VH/mm0.60±0.04c0.83±0.14b1.07±0.13a0.002CD/mm0.16±0.02b0.20±0.02ab0.21±0.02a0.038V/C3.88±0.42b4.32±0.55ab5.10±0.52a0.043回肠VH/mm0.53±0.09b0.76±0.06a0.78±0.09a0.009CD/mm0.17±0.020.17±0.020.16±0.030.952V/C3.11±0.38b4.55±0.35a4.90±0.51a0.001注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2不同锌源对热应激马岗鹅盲肠微生物群的影响2.2.1不同锌源对物种组成的影响使用韦恩图分析各组马岗鹅盲肠微生物共有和特有OUTs，可反映所有样本的相似性和重叠程度，结果见图1。由图1可知，各组共有717个OTUs，其中CON组特有534个OTUs，ZnO 60组特有为653个OTUs，AsA-Zn 60组特有为577个OTUs。由此得出，各组马岗鹅盲肠微生物群数目顺序为ZnO 60组AsA-Zn 60组CON组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F001图1韦恩分析结果2.2.2不同锌源对马岗鹅盲肠微生物水平的影响（见图2、图3）由图2可知，各组间门水平上相对丰度前17的物种依次为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、迷踪菌门（Elusimicrobia）、互氧菌门（Synergistetes）、未分类的菌门（unclassified）、广古菌门（Euryarchaeota）、软壁菌门（Tenericutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、糖细菌（TM7）、黏胶球形菌门（Lentisphaerae）、梭杆菌门（Fusobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）和酸杆菌（Acidobacteria）。其中，以拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）占比最多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F002图2微生物门水平组成分析由图3可知，在热应激条件下，与CON组相比，日粮中添加ZnO和AsA-Zn可显著降低马岗鹅盲肠拟杆菌门的相对丰度（P0.05），显著提高厚壁菌门和蓝藻菌门的相对丰度（P0.05）。与CON组相比，日粮中补充ZnO和AsA-Zn显著提高马岗鹅盲肠变形菌门的相对丰度（P0.05），排序为AsA-Zn60组ZnO 60组CON组。图3门水平主要微生物群落丰度分布注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F3a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F3a22.2.3微生物LEfSe分析使用LEfSe方法进行各组间属水平微生物差异菌群分析，得到各组间对应的特征微生物，结果见图4。由图4可知，LDA值大于4的微生物物种有12个，其中，AsA-Zn 60组有10个，分别是气单胞菌属（Aeromonas）、琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）、变形杆菌属（Proteus）、丙型变形杆菌属（Gammaproteobacteria）、幽门螺杆菌属（Helicobacter pylori）、螺杆菌属（Helicobacter）、厌氧螺菌属（Anaerobiospirillum）、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）、颤螺旋菌属（Oscillospira）、巨单胞菌属（Megamonas），CON组有2个，分别是微单胞菌属（Micromonospora）、拟杆菌属（Bacteroides）；ZnO 60组未发现有差异的微生物群。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F004图4盲肠微生物LEfSe分析结果（属水平）2.2.4Alpha多样性分析使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal Wallis）法分析各组间Alpha多样性指数的差异显著性，结果见图5。图5Alpha多样性分析结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F5a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F5a2由图5可知，与CON组相比，AsA-Zn 60组Shannon、Simpson指数显著升高（P0.05）。ZnO 60组的Simpson指数显著高于CON组（P0.05）。2.2.5Beta多样性分析为进一步研究肠道微生物群落组成的差异，采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）Beta多样性，根据观察或测量到的变量值，按照类别进行分组，同时忽略组内的随机差异，突出组间系统差异，结果见图6。由图6可知，各组间可明显区分且距离较远，表明各组间分类模型效果较好，有差异物种的存在。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F006图6Beta多样性分析结果2.2.6盲肠微生物功能预测结果（见图7）图7盲肠微生物功能预测结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F7a1（a）微生物群功能预测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.007.F7a2（b）具有显著差异的通路由图7（a）可知，各组间盲肠微生物群主要影响硫胺素代谢（thiamine metabolism）和丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）、光合生物体中的碳固定作用（carbon fixation in photosynthetic organisms）、由叶酸组成的一个碳库（one carbon pool by folate）、硫辛酸代谢（lipoic acid metabolism）、泛酸盐和辅酶A生物合成（pantothenate and CoA biosynthesis）、蛋白质输出（Protein export）、氨酰生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）、肽聚糖生物合成（peptidoglycan biosynthesis）、细胞周期-大肠杆菌（cell cycle-caulobacter）、核糖体（Ribosome）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、错配修复（mismatch repair）、链霉素生物合成（streptomycin biosynthesis）、生物素代谢（biotin metabolism）、其他聚糖降解（other glycan degradation）、D-丙氨酸的代谢（D-alanine metabolism）、脂肪酸的生物合成（fatty acid biosynthesis）以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成（D-glutamine and D-glutamate metabolismvaline, leucine and isoleucine biosynthesis）等通路。由图7（b）可知，AsA-Zn 60组马岗鹅盲肠微生物D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢（D-arginine和D-ornithine metabolism）通路之和显著提高（P0.05）。3讨论3.1不同锌源对热应激马岗鹅小肠形态的影响肠道是机体重要的消化器官，常通过肠道VH、CD和V/C等指标反映肠道健康和完整性。VH和V/C与肠道吸收效率成正比，数值越高则肠道吸收能力越强[16]。但热应激对肠道的影响通常表现在肠道完整性的丧失，导致肠道通透性增加诱导全身炎症反应，以及肠道VH降低和CD增加，导致V/C降低，继而影响禽类消化吸收和生长性能[17]。研究表明，有机锌（氨基酸螯合锌）可改善小肠金属硫蛋白基因的相对表达量和肠道形态促进锌的吸收和利用[18-19]。Opgenorth等[6]在热应激状态下的动物日粮中补充有机锌（锌氨基酸复合物），可显著提高空肠和回肠绒毛高度，且优于无机锌（硫酸锌）。日粮中添加维生素C和ZnO可通过提高肉鸡抗氧化性能和肠道形态，改善热应激条件下肉鸡的饲料转化率、免疫功能和胴体特性[20]。本研究中，日粮中添加AsA-Zn可提高空肠的VH、CD和V/C，提高回肠的VH以及十二指肠、空肠和回肠的V/C。AsA-Zn提高空肠VH的效果优于ZnO，与前人研究结果一致，表明AsA-Zn与其他有机锌相似，通过改善小肠形态的完整性进而提高有机锌的利用。3.2不同锌源对热应激马岗鹅盲肠微生物群的影响热应激影响禽类的肠道微生物群，阻碍其生长发育[21]。锌是禽类机体必不可少的营养物质，具有重要的催化和调节功能，在动物体内及其常驻肠道微生物群均需要锌维持肠道微生物群的平衡[22]。本研究中，在日粮中添加锌源可提高热应激马岗鹅盲肠微生物群特有OUTs数目。李筝等[23]研究表明，鹅肠道微生物群主要以拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门为优势菌门，与本研究的结果一致。日粮中添加不同锌源未改变马岗鹅盲肠主要的细菌门，显著降低拟杆菌门，并显著提高厚壁菌门、变形菌门和蓝藻菌门的相对丰度。厚壁菌门参与并促进机体对能量的吸收和抑制病原菌的生长，拟杆菌门参与物质的代谢并维持肠道微生物平衡和修复肠黏膜的能力[24]。由此可推测日粮中添加锌源可通过增加优势微生物群的相对丰度，促进营养物质的吸收和利用，进而缓解马岗鹅小肠形态受热应激的影响。在肠道微生物群组成中，厚壁菌科主要包括乳杆菌科和瘤胃球菌科，其次是乳杆菌科、绒毛菌科和丹毒科。其中瘤胃球菌科和乳腺螺旋体科减少可能是炎症发生的原因[25]。同时，锌的生物利用率提高可以上调瘤胃球菌属的相对丰度。瘤胃球菌属可降解食物中的纤维素或多糖，产生短链脂肪酸维持肠道生态系统健康；而变形杆菌门与肠道生态失调和炎症性疾病有关[26]。综合LEfSe分析结果可知，AsA-Zn 60组可以显著增加热应激马岗鹅盲肠瘤胃球菌属，表明AsA-Zn 60具有缓解马岗鹅炎症发生的潜力，并在维持肠道系统平衡中起到关键作用。但变形菌门的增加却与该结果相反，因此具体作用效果还需进一步研究证明。Alpha多样性指数是对某个样品中物种多样性的分析，包含样品中的物种组成的丰富度和均匀度等两个因素，其中Chao1指数、Ace指数反映群落丰富度；Simpson指数和Shannon指数常用于评价群落多样性，其数值越高，表明群落多样性越高[27]。本研究中，与CON组相比，AsA-Zn 60组和ZnO 60组热应激马岗鹅肠道Shannon指数和Simpson指数均有所提高，表明日粮中添加锌源可改变热应激马岗鹅盲肠微生物群的多样性，但不改变群落的丰富度。同时，通过PLS-DA分析可知，日粮中添加60 mg/kg ZnO和60 mg/kg AsA-Zn也可影响热应激马岗鹅盲肠微生物群。通过对盲肠微生物群代谢功能预测发现，在饲料中添加ZnO和AsA-Zn可影响热应激马岗鹅盲肠多种氨基酸的合成与代谢、脂肪酸的合成以及核糖体、肽聚糖生物合成和蛋白质输出，这些功能表明热应激马岗鹅的生长发育和营养物质的吸收利用关系重大[28]。研究表明，精氨酸通过将精氨酸酶水解为鸟氨酸和尿素而形成精氨酸-鸟氨酸通路，并通过激活核因子E2相关因子2（NRF2）/抗氧化应答元件（ARE）信号通路（Nrf2/ARE）信号通路提高抗氧化蛋白含量，缓解氧化应激改善肠道损伤和免疫力，促进动物生长[29]。盲肠微生物群功能相关通路的预测发现，在日粮中添加60 mg/kg AsA-Zn可显著提高热应激马岗鹅盲肠D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢通路，效果优于ZnO，表明AsA-Zn在提高小肠组织发育的同时，也维持着肠道微生物群之间的平衡，继而促进热应激马岗鹅的肠道健康。4结论本研究结果表明，日粮中额外添加60 mg/kg的ZnO或AsA-Zn均可改善热应激状态下马岗鹅的小肠形态和盲肠微生物群。AsA-Zn可改善空肠VH值、CD值和V/C，调节盲肠变形菌门、微生物差异菌群，提高Simpson指数，增加D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢通路，效果优于ZnO。