培育犊牛是肉牛产业高质量发展的关键生产环节，提升犊牛饲养水平，可以提高肉牛后期的生长发育[1]。饲喂营养水平为粗蛋白（CP）20.20%、综合净能（NE）3.65 MJ/kg的饲粮，可促进西门塔尔犊牛生长，增加体重[2]。然而，关于安格斯犊牛断奶时期的饲粮营养水平的相关研究报道较少。本试验旨在研究断奶时期不同蛋白水平饲粮对安格斯犊牛生长性能、血清免疫、抗氧化指标、瘤胃发酵及微生物组成的影响，为犊牛断奶阶段配制适宜营养水平的饲粮提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验选取90日龄断奶安格斯犊牛18头，平均体重为（138.19±0.94） kg，随机分为3组，每组6个重复，每个重复1头犊牛。试验饲粮根据《肉牛饲养标准》（NY/T 815—2004）设计3种蛋白水平饲粮（高蛋白T组：CP 19.65%、NE 5.74 MJ/kg；中蛋白S组：CP 18.60%、NE 5.62 MJ/kg；低蛋白F组：CP 17.76%、NE 5.40 MJ/kg）。试验期100 d。犊牛试验颗粒料由宁夏银川天卓饲料有限公司提供，精粗比为40∶60，颗粒料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T001表1颗粒料组成及营养水平（干物质基础）项目T组S组F组原料组成/%玉米565555次粉666麸皮058豆粕332926预混料555合计100100100营养水平综合净能/(MJ/kg)5.745.625.40粗蛋白质/%19.6518.6017.76赖氨酸/%0.980.910.85蛋氨酸/%0.300.280.26苏氨酸/%0.750.700.67中性洗涤纤维/%25.7427.1329.25酸性洗涤纤维/%13.2214.7915.11注：1.预混料为每千克颗粒料提供：VA 25 000 IU、VD 600 IU、VE 100 IU、铁80 mg、铜12 mg、锌80 mg、锰70 mg、硒0.40 mg、碘1 mg、钴0.80 mg。2.营养水平中综合净能为计算值，其余均为测定值。1.2测定指标及方法1.2.1生长性能试验开始每隔4周晨饲前称量犊牛体重，记录饲料投入量和剩余量，计算采食量、平均日增重和料重比。平均日干物质采食量=总采食量/试验天数(1)平均日增重=(试验末重-试验初重)/试验天数(2)料重比=平均日干物质采食量/平均日增重(3)1.2.2血清指标试验结束后，在犊牛晨饲前尾静脉采血5 mL，离心收集血清，测定血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）。血清生化指标试剂盒购自爱德士公司，免疫指标试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司，抗氧化指标鉴定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2.3瘤胃发酵参数试验结束后，采集犊牛瘤胃液进行微生物发酵参数分析，主要检测微生物蛋白和挥发性脂肪酸含量。采用考马斯亮蓝法测定微生物蛋白含量[3]，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法测定挥发性脂肪酸含量。1.2.4瘤胃微生物组成试验结束后，利用瘤胃液采集器采集犊牛瘤胃液，分装至50 mL离心管中，置于-80 ℃冻存。将瘤胃液送往上海天昊生物科技有限公司，利用Accu16STM细菌绝对定量方法进行瘤胃菌群多样性分析。Accu16STM细菌绝对定量测序主要包括细菌16S rRNA V3、V4、V3V4和V4V5区域检测。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行初步统计整理，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1饲粮蛋白水平对犊牛生长性能的影响（见表2）由表2可知，T组犊牛120日龄体重、180日龄体重和平均日增重显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T002表2饲粮蛋白水平对犊牛生长性能的影响组别90日龄体重/(kg/头)120日龄体重/(kg/头)180日龄体重/(kg/头)平均日增重/[kg/(头·d)]平均日干物质采食量/[kg/(头·d)]料重比T组138.07±1.82167.15±3.18a248.21±20.40a1.22±0.22a4.69±1.123.84±0.74S组138.45±4.94151.67±10.23b226.26±14.27b0.97±0.20b5.01±1.625.16±1.05F组139.04±5.67148.15±10.73b216.86±25.20b0.86±0.33b4.07±0.134.73±1.10注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3~表5、表7与此同。2.2饲粮蛋白水平对犊牛血清免疫指标的影响（见表3）由表3可知，T组犊牛血清IgA和IgM含量显著高于其他组（P0.05），TNF-α含量显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T003表3犊牛饲粮蛋白水平对血清免疫指标的影响组别IgA/(g/L)IgG/(g/L)IgM/(mg/L)IL-2/(ng/L)IL-4/(ng/L)IL-10/(ng/L)TNF-α/(ng/L)T组2.23±0.08a4.87±0.511.23±0.05a0.60±0.0248.58±2.3949.14±2.87102.88±10.22bS组1.98±0.19b4.65±0.151.03±0.13b0.68±0.2251.36±2.4451.61±1.33115.14±2.90aF组1.88±0.08b4.74±0.931.01±0.11b0.57±0.0644.87±2.7546.09±7.12118.32±10.11a2.3饲粮蛋白水平对犊牛血清生化、抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与F组相比，T组、S组犊牛血清SOD和GSH-Px活性显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T004表4饲粮蛋白水平对犊牛血清生化、抗氧化指标的影响组别T-AOC/(mmol/L)SOD/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)MDA/(μmol/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)T组0.54±0.0265.97±8.81a146.05±37.10a0.84±0.1327.67±3.8897.00±17.64S组0.53±0.0464.74±2.23a142.79±22.97a0.97±0.2428.00±5.6698.17±12.01F组0.57±0.0352.89±8.47b118.61±31.79b1.58±0.3030.17±4.07101.83±20.632.4犊牛饲粮蛋白水平对瘤胃发酵参数的影响（见表5）由表5可知，T组、S组犊牛瘤胃液乙酸含量显著高于F组（P0.05）；T组戊酸含量极显著高于S组、F组（P0.01），丙酸含量极显著高于F组（P0.01），显著高于S组（P0.05）；S组异丁酸浓度显著高于其他组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T005表5犊牛饲粮蛋白水平对瘤胃发酵参数的影响组别微生物蛋白/(g/L)乙酸/(mg/L)丙酸/(mg/L)丁酸/(mg/L)异丁酸/(mg/L)异戊酸/(mg/L)戊酸/(mg/L)T组376.08±64.363 867.44±220.50a999.17±51.25Aa1 025.96±74.37192.70±10.62B242.61±86.36814.93±27.17AS组409.26±38.813 348.32±154.43a903.22±26.84Ab1 218.25±44.16306.71±19.05A284.73±83.90542.01±16.26BF组357.27±34.712 462.49±120.30b684.96±31.91Bc882.65±46.92103.30±31.35B190.88±11.53473.38±32.52B2.5饲粮蛋白水平对瘤胃微生物组成的影响2.5.1安格斯犊牛瘤胃液样本序列信息、序列过滤与质控（见表6、图1）由表6可知，3组测序样本通过序列拼接及质控，共得到749 915条有效序列，共得到599 280条优化序列。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T006表6样本序列信息项目T组S组F组原始序列数241 155.0240 808.0267 952.0过滤后的剩余序列数210 347.2210 735.5237 868.8拼接成功序列数与原始下机序列数的比值87.387.588.8降噪后剩余序列数208 881.5208 945.3234 818.6合并序列203 824.2203 197.5218 309.8拼接成功序列数与原始下机序列数的比值84.684.482.2去除嵌合体后剩余序列数199 094.8197 226.5202 959.4去除嵌合体后剩余序列数与原始下机序列数的比值82.6681.9077.00优化序列长度分布见图1，主要分布于403~408、421~426 bp。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F001图1优化序列长度分布2.5.2饲粮蛋白水平对瘤胃微生物群落的Alpha多样性的影响（见表7）由表7可知，3组犊牛瘤胃菌群数量及组成相似，菌群丰度较大，多样性指数也处于较高的水平，物种覆盖度达到99.99%。T组ChaoI指数、ACE指数和Shannon指数显著高于S组、F组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.T007表7饲粮蛋白水平对瘤胃微生物群落的Alpha多样性的影响组别Observed指数ChaoI指数ACE指数Shannon指数Simpson指数Coverage指数T组1 156.01 631.198a1 596.898a5.816 326a0.012 6860.999 882S组1 502.01 509.081b1 506.765b5.690 286b0.010 0450.999 882F组1 521.61 531.954b1 533.396b5.647 546b0.009 7170.999 7772.5.3犊牛瘤胃微生物稀释性曲线（见图2）由图2可知，犊牛瘤胃菌群稀释曲线在97%的条件下，3组的瘤胃菌群稀释曲线较缓上升，表明数据测序科学合理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F002图2犊牛瘤胃微生物稀释性曲线2.5.4Venn图分析（见图3）由图3可知，3组瘤胃菌群操作分类单元（OTU）总数量为8 242个，F组的OTU总数为4 333个，S组的OTU总数量为3 913个，T组的OTU总数量为4 646个；3组共享的OTU总数为1 515个，占OUT总数的18.18%。F组独有的OTU数量为1 930个，占总OTU数量的23.42%；S组组独有的OTU数量为1 353个，占总OTU数量的16.42%；T组独有的OTU数量为2 006个，占总OTU数量的24.34%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F003图3Venn图分析2.6饲粮蛋白水平对犊牛瘤胃微生物组成的影响2.6.1饲粮蛋白水平对犊牛瘤胃细菌属水平多样性（见图4）由图4可知，3种不同蛋白水平饲粮对犊牛瘤胃属水平上微生物无显著影响（P0.05）。图4瘤胃微生物属水平组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F4a1（a）T组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F4a2（b）S组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F4a3（c）F组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F4a4（d）各组瘤胃微生物属水平差异2.6.2饲粮蛋白水平对犊牛瘤胃细菌门水平多样性（见图5）由图5可知，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为犊牛瘤胃微生物在门水平上的2个优势菌门。3个试验组中，厚壁菌门的相对丰度分别为40.15％、32.27％、45％，拟杆菌门的相对丰度分别为55.2％、55.9％、45.69％。瘤胃中厚壁菌门相对丰度随着饲粮蛋白水平增加而呈下降趋势。图5瘤胃微生物门水平组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F5a1（a）T组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F5a2（b）S组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F5a3（c）F组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F5a4（d）各组瘤胃微生物门水平差异2.6.3饲粮蛋白水平对断奶犊牛瘤胃微生物组成Beta多样性分析（见图6）由图6可知，3组样品组间的微生物群落组成和物种组成结构相似，3组样品组内群落结构相似度高，群落组成越相似。图6瘤胃微生物组成Beta多样性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F6a1（a）各组样本PCA差异10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F6a2（b）各组样本PCoA差异10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F6a3（c）各组样本PLS_DA差异2.6.4饲粮蛋白水平对断奶犊牛瘤胃微生物组成差异分析（见图7）由图7可知，T组中主要影响微生物组成的差异物种为密螺旋体属未培养菌（g__Treponema. s__uncultured_rumen_bacterium），S组中主要影响微生物组成的差异物种为RF37未培养的菌（s__unidentified_rumen_bacterium_RF37），F组中主要影响微生物组成的差异物种为溶藻弧菌（p_SR1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.002.F007图7线性判别分析（LDA）值分布柱状图3讨论3.1饲粮蛋白水平对犊牛生长性能的影响在肉牛犊牛养殖中，评价犊牛经济价值直接、有效的指标是生长性能[2]。畜体的生长性能主要受饲养管理影响，尤其是饲粮的营养水平[4]。饲粮中蛋白水平既是影响动物生长发育的关键因子，也是饲粮的重要营养指标。高蛋白水平饲粮可促进机体对饲粮重要营养成分的利用和吸收，从而提高动物生长速度[5]。饲粮组成和营养水平对犊牛生长发育的影响的研究较多。崔祥等[6]研究发现，断奶牦牛犊牛在自由采食的情况下补饲营养水平较高的饲粮，可提高其生长性能。王秉龙等[7]研究发现，低营养水平饲喂断奶犊牛会影响其生长性能和瘤胃发酵功能。高兴超等[8]研究发现，舍饲组牦牛犊牛饲喂营养水平高饲料可促进其体重增加，180日龄犊牛的体重和平均日增重随日粮能量增加呈增长趋势。张颖楠等[2]研究发现，高营养水平饲粮可促进安格斯公牛对营养物质的消化吸收，显著提高日增重。李岩等[3]研究发现，饲喂高营养水平日粮（CP 20.20%、NE 3.65 MJ/kg）时，断奶西门塔尔犊牛平均日增重和料重比显著提高。杨天宇等[9]研究发现，高蛋白水平饲粮（CP 21.02%）可促进荷斯坦犊牛的生长发育，其调节机制为犊牛采食高蛋白饲粮后，肝脏中氨基酸含量不断增加，糖异生途径重要基因的mRNA获得较多合成，加快了肝脏葡萄糖生成，为机体提供了充足能量，从而促进体重增长。张春霞[10]研究发现，西门塔尔牛育肥过程中，前期饲粮高蛋白水平可促进西门塔尔牛生长。唐振华等[11]发现，饲粮CP水平为17.5%时，围产期奶水牛产奶量和饲料转化率最高。本试验结果与上述研究结果一致，表明饲喂高蛋白水平饲粮可显著提高犊牛120日龄、180日龄体重和平均日增重，生长发育情况好，提示要保证犊牛饲粮营养水平适宜，断奶时期犊牛才能得到充分营养以促进其生长发育。3.2饲粮蛋白水平对犊牛血清免疫指标的影响IgA、IgG和IgM是反映动物机体血清中免疫功能的关键因子，可反映动物机体免疫能力。本研究中，高蛋白水平饲粮可提高犊牛血清IgA和IgM含量，可能是犊牛采食高营养水平饲粮促进了体重增长，提高了机体免疫力。细胞因子在机体发生促炎和抗炎过程中发挥着重要作用，尤其TNF-α是关键的促炎因子，具有生物学活性和免疫调节功能。前期研究发现，饲喂高蛋白水平（CP 22.05%、NE 5.40 MJ/kg）饲粮，犊牛血清免疫球蛋白E（IgE）、IgG的含量显著增加，TNF-α含量显著降低[12]。唐晶[13]研究发现，高能量（13.62 MJ/kg）饲粮会显著降低安格斯犊牛TNF-α含量。3.3饲粮蛋白水平对犊牛血清抗氧化指标的影响动物生理及其机体健康状态可用血清抗氧化指标作为评价。近年来，有关饲粮营养水平对犊牛血清免疫指标影响的研究较多。王秉龙等[7]研究发现，高蛋白水平（CP 10.81%、NE 6.63 MJ/kg）可显著增加血清葡萄糖、总蛋白、尿素氮含量。高兴超等[8]研究发现，饲粮CP水平为18.13%、NE水平为3.37 MJ/kg时可极显著升高犊牛血清AST活性。前期研究发现，高蛋白水平（CP 22.05%、NE 5.40 MJ/kg）饲粮可显著提高犊牛血清总蛋白、血糖、尿素氮的含量和AST活性[12]。本试验发现，高蛋白水平组犊牛血清SOD和GSH-Px活性明显增强，表明犊牛摄入高营养饲粮后，可促进饲粮中营养物质的消化吸收满足了生长发育的营养需求[7]。在饲粮营养均衡的前提下，饲粮中营养物质被机体充分吸收利用[14]，加快了机体的新陈代谢和营养吸收，体重增长较快，抗氧化指标升高。上述研究结果均表明，饲粮营养水平会直接影响犊牛的生长发育质量和体重的增长，因此应给予断奶时期犊牛营养水平适合的饲粮以维持机体生长发育，提高机体免疫功能。3.4饲粮蛋白水平对犊牛瘤胃发酵参数的影响反刍动物采食饲料后，借助瘤胃微生物将其发酵为挥发性脂肪酸，以获取能量用于机体新陈代谢。唐晶[13]研究发现，饲喂高能量的开食料，犊牛瘤胃内乙酸、异丁酸和异戊酸含量升高。高兴超等[8]研究发现，饲粮能量水平可显著提高瘤胃丙酸比例，降低乙酸和异丁酸比例。黄开武[15]研究发现，不同蛋白水平对63日龄犊牛瘤胃丁酸、总挥发性脂肪酸丙酸、丁酸含量的影响差异显著。黄杰[16]研究发现，添加高蛋白水平的饲粮可显著提高瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量。柏峻等[17]研究表明，饲粮能量水平可增加瘤胃液乙酸含量，减少丙酸含量，增加总挥发性脂肪酸（TVFA）含量。霍路曼[18]研究发现，饲喂CP水平为14.04%、NE水平为6.21 MJ/kg的饲粮，对荷斯坦育成牛瘤胃微生物蛋白产量、乙酸、丁酸、TVFA的含量及乙酸/丙酸影响不显著。Wang等[19]研究发现，饲粮代谢能为10.90、11.68 MJ/kg时会降低了瘤胃液细菌多样性，改变了细菌的相对丰度，降低了瘤胃液乙酸浓度，提高了丁酸和戊酸浓度。Dong等[20]研究发现，在能量水平相近的情况下，饲粮蛋白水平会影响瘤胃液乙酸、丙酸、丁酸和TVFA含量。本试验中，犊牛饲喂高蛋白水平饲粮，瘤胃乙酸含量明显增加，丙酸、异丁酸、戊酸含量显著提高，与上述唐晶[13]、黄开武[15]、黄杰[16]、Dong等[20]试验结果一致，表明高蛋白水平饲粮提高了犊牛机体对氮的利用率，使瘤胃发酵类型改变，偏向乙酸、丙酸类型，更利于机体获得能量。3.5饲粮蛋白水平对犊牛瘤胃微生物组成的影响瘤胃微生物菌群受到饲粮构成和营养水平的制约，继而影响瘤胃发酵功能。陈林[21]研究发现，犊牛断奶后瘤胃细菌菌群的多样性降低，而随着日龄增加，菌群的多样性逐渐恢复增加，拟杆菌门、Prevotella7的丰度显著增加，TVFA、乙酸、丙酸以及尿素氮的含量与瘤胃细菌菌落的组成显著相关，挥发酸的含量可能是影响瘤胃细菌菌落的关键因素。李岩等[3]研究发现，低营养水平饲粮饲喂断奶犊牛会改变其瘤胃菌群，进而影响瘤胃发酵功能。唐晶[13]研究发现，饲粮营养水平可提高瘤胃挥发性脂肪酸含量，降低瘤胃内微生物多样性，建议安格斯犊牛开食料CP水平为23.17%、NE水平为11.19 MJ/kg左右为宜。祁敏丽[22]研究发现，3~4月龄羔羊瘤胃微生物组成收到饲粮蛋白水平较为明显的影响，琥珀酸丁酸弧菌的丰度发生了变化。李红丽[23]研究发现，牦牛育肥后期饲粮蛋白水平会造成瘤胃纤维杆菌门和瘤胃球菌属丰度显著下降。郭凯等[24]研究发现高蛋白饲粮（CP 22%）会提高瘤胃菌群多样性Chao指数，瘤胃菌群在门水平和属水平上差异均不显著。本试验发现，高蛋白水平组犊牛瘤胃菌群多样性指数显著增加，但在属水平上瘤胃微生物无显著影响，菌群相对丰度较高的为厚壁菌门和拟杆菌门。结果表明，饲粮蛋白水平可导致瘤胃菌群的相对丰度改变。因此，在犊牛断奶饲养管理过程中，应饲喂较高营养水平饲粮以确保犊牛健康生长发育。4结论在本试验条件下，断奶安格斯犊牛饲喂高蛋白饲粮（CP 19.65%、NE 5.74 MJ/kg）有利于机体生长和瘤胃发酵功能，显著增加了犊牛体重，同时不会影响断奶犊牛瘤胃微生物区系稳态建立。