仔猪断奶应激综合征是制约规模化养猪业发展的关键问题。仔猪断奶应激由氧化应激、炎症反应、肠道屏障功能损伤引起,可造成养猪业经济损失[1]。炎症是机体对外源病原入侵的抵抗反应,过度的炎症反应会使活性氧(ROS)含量升高。氧化应激是由ROS诱导产生的一种应激状态,可以引起细胞DNA损伤、细胞周期异常,导致细胞凋亡,对机体造成损害[2]。肠道的氧化平衡状态对维持肠道黏膜的完整性、促进营养物质的吸收、调节肠黏膜的再生修复具有重要作用。为了缓解仔猪断奶应激综合征,可以采用抗生素进行治疗,但是抗生素的不规范使用会影响动物食品安全[3]。中药提取物具有资源丰富、功能多样、经济环保、残留量小、耐药能力弱、副作用低等特性。中兽药在治疗畜禽疾病中起到重要作用[4-5],研发高效植物提取物等新型绿色添加剂、新型中兽药等生物制剂是目前面临的首要问题[6]。目前,农业农村部已允许将黄芩提取物列入饲料添加剂名录。黄芩苷源于黄芩干燥的根部,属于黄酮类化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[7]。黄酮类化合物具有溶解性差、生物利用率低等缺点[8],导致黄酮类化合物在临床中的应用受到限制[9-10]。以天然黄芩苷为底物进行酯化反应,酯化后形成的黄芩苷酯化物易通过细胞膜进入细胞内。目前,针对黄芩苷酯化物的研究较少,对于肠道炎症反应及氧化应激的治疗未见报道,具体的作用机制尚不明确。因此,本试验主要研究黄芩苷酯化物如何调控H2O2诱导的IPEC-J2细胞的氧化应激反应及作用机制。1材料与方法1.1试验材料85%黄芩苷(BAI)、IPEC-J2细胞购自北纳生物科技有限公司,黄芩苷酯化物(BE)采用85%的黄芩苷(购自湖北宏远达生物科技有限公司)与正丁醇通过酯化反应获得,黄芩苷正丁酯得率86%,30% H2O2溶液购自国药集团。1.2试验试剂试验中所用到的试剂见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.T001表1试验试剂名称公司货号ROS ELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-3284901SOD ELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-0389M2MDA ELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-191601CAT ELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司MM-3284902苏木精、伊红染液LabcomsTMLife Science公司—Trizol reagentInvitrgen公司15596-026EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix北京全式金生物技术有限公司AE311EasyScript Green qPCR SuperMix北京全式金生物技术有限公司AQ101RIPA蛋白裂解液上海碧云天生物技术有限公司P0013BNrf2抗体Cell Signaling Technology公司#12721β-actin抗体Cell Signaling Technology公司#4970LaminB抗体abcam公司ab16048BCA试剂盒上海碧云天生物技术有限公司KGP1100HO-1抗体abcam公司EP1391YSDS-PAGE试剂盒江苏康为世纪生物科技股份有限公司CW2384S注:“—”表示无货号。1.3细胞分组及处理在Dulbecco改良培养基[DMEM/F-12(1∶1)碱性,C11330500BT,Gibco,USA]中培养猪肠上皮细胞IPEC-J2,培养基中补充10%胎牛血清(FBS),加入50 IU/mL青霉素和50 g/L链霉素(青霉素-链霉素,15140-122,Gibco,USA),置于37 °C和5% CO2的细胞培养箱中,培养48 h。当细胞培养至70%时,利用BAI预处理24 h后再利用10 mol/mL H2O2刺激IPEC-J2细胞1 h。为检测BE处理后的细胞活力,将铺满板的细胞变成悬浮液,将等数量的细胞接种在96孔板中(无锡NEST生命科技有限公司),并在DMEM/F12培养基(含有10% FBS)中培养。生长达到80%后,使用PBS液洗涤细胞2次,血清饥饿2 h,采用不同浓度的BE处理24 h(10~160 mL/L),将10 μL的CCK-8试剂(C0038,Dojindo,JPN)加入需要检测的孔中,将96孔板置于37 °C、5% CO2的条件下培养1 h,试验结束后将96孔板放进酶标仪里测量450 nm吸光度。为确定BE处理后的细胞活力,将相同数量的IPEC-J2细胞接种在96孔板中,在含有10% FBS的DMEM/F12培养基中培养。IPEC-J2细胞生长到95%后,采用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞2次,血清饥饿2 h,采用不同浓度的BE(10~160,mmol/L)处理细胞24 h,血清饥饿2 h,采用10 mol/mL H2O2处理3 h,接着向每孔加入10 μL CCK-8试剂,将IPEC-J2细胞在37 °C、5% CO2的条件下孵育1 h。采用酶标仪测量450 nm吸光度。试验分组和药物处理见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.T002表2试验分组和药物处理组别药物处理对照组(CON)无处理模型组(H2O2)IPEC-J2(H2O2 10 mol/mL)低剂量BE组(L-BE)IPEC-J2(H2O2 10 mol/mL)+10 mmol/L黄芩苷酯化物中剂量BE组(M-BE)IPEC-J2(H2O2 10 mol/mL)+20 mmol/L黄芩苷酯化物高剂量BE组(H-BE)IPEC-J2(H2O2 10 mol/mL)+40 mmol/L黄芩苷酯化物BAI组IPEC-J2(H2O2 10 mol/mL)+20 mmol/L黄芩苷1.4酶联免疫吸附试验将IPEC-J2细胞在6孔板中培养至80%,采用PBS洗涤细胞及不同浓度的BAI(10~40 mmol/L)处理细胞24 h,再用PBS洗涤细胞及10 mol/mL H2O2处理细胞1 h后收集上清液。上清液使用ELISA试剂盒测定ROS、MDA、SOD、CAT。1.5RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR使用Trizol试剂从IPEC-J2细胞中提取RNA,利用OD1000仪器测定RNA浓度。采用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂将提取的RNA反转录成cDNA,使用EasyScript Green qPCR SuperMix试剂和特异性引物扩增cDNA。利用特异性引物在实时荧光定量PCR仪器中对mRNA进行扩增。最后对得出的数据进行分析整理。PCR引物序列见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.T003表3荧光定量PCR引物序列基因引物序列(5'→3')Genebank登录号长度/bpβ-actinF:TATGCTCTCCCTCACGCCATCCAY550069220R:GTCACGCACGATTTCCCTCTCAGHO-1F:TGCTGAATGCCTGAATGCCTGTCNC_000074.780R:TCCTGCCTCCCTCAACTGTGTGNQO-1F:TGTAGACCGGGTTCTCCTTGNC_000074.7138R:TGAATTACATCTCTGTGGTTTA1.6蛋白测定利用RIPA裂解液以及核和细胞质蛋白提取试剂盒(KeyGEN,BioTECH,KGP1100,CHN)对IPEC-J2细胞中蛋白进行提取。利用BCA工作液(含A液与B液)测定蛋白的浓度,SDS-PAGE试剂盒分离蛋白,使用转膜仪将所需的蛋白转移至0.22 μm PVDF膜上进行快速封闭。封闭结束后用1∶1000比例稀释的一抗孵育膜进行孵育,再利用同样比例稀释的HRP标记的二抗孵育膜进行孵育,期间使用TBST对膜进行洗涤。最后对膜进行曝光,使用ECL检测系统对膜进行曝光显现印迹,并使用ChemiDoc XRS+图像分析仪进行蛋白质的定量。1.7免疫荧光将生长到约50%的IPEC-J2细胞在冰上利用4%多聚甲醛处理IPEC-J2细胞15 min,利用PBS洗涤细胞3次,0.2% tritionx-100透化5 min,再利用PBS洗涤3次,1%胎牛血清(BSA)封闭30 min。在冰上利用1∶100稀释的一抗、HO-1孵育过夜,利用PBS洗涤3次,滴加1∶100稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)(715-065-151,英国杰克逊免疫研究)在37 ℃孵育1 h。对细胞利用PBS洗涤细胞3次,并滴加1∶100稀释的a594-sav(016-580-084,英国杰克逊免疫研究)在37 ℃孵育1 h,对细胞利用PBS洗涤3次。在室温下滴加1∶500稀释的DAPI 3 min,在共聚焦显微镜上进行IPEC-J2细胞的图像。1.8数据统计与分析数据使用SPSS 12.0进行单因素方差分析,Tukey法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1BE的细胞毒性及其对氧化应激模型的治疗作用(见图1)图1BE对IPEC-J2细胞毒性及对H2O2刺激的细胞活力的影响注:“*”表示与对照组相比差异显著(P0.05);#表示与模型(H2O2)组相比差异显著(P0.05);下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F1a1(a)BE对IPEC-J2细胞安全浓度的筛选10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F1a2(b)H2O2刺激、BE预处理对IPEC-J2活力的影响由图1(a)可知,20 mmol/L BE显著增加了IPEC-J2细胞活力(P0.05);10~40 mmol/L BE处理IPEC-J2细胞24 h未显著改变IPEC-J2细胞的活力;80 mol/mL或更高浓度BE处理IPEC-J2细胞24 h显著抑制IPEC-J2细胞活力(P0.05)。由图1(b)可知,与对照组相比,H2O2显著降低IPEC-J2细胞的活力;与模型组相比,高剂量BE组可以显著提高IPEC-J2细胞的活力(P0.05)。2.2BE对H2O2刺激的IPEC-J2细胞抗氧化指标的影响(见图2)由图2可知,与对照组相比,H2O2组中ROS和MDA的含量显著升高(P0.05),SOD和CAT的活性显著降低(P0.05)。图2BE对H2O2刺激的IPEC-J2细胞抗氧化指标的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F2a1(a)BE对IPEC-J2细胞ROS含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F2a2(b)BE对IPEC-J2细胞MDA含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F2a3(c)BE对于IPEC-J2细胞SOD活性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F2a4(d)BE对于IPEC-J2细胞CAT活性的影响与H2O2组相比,中、高剂量的BE组能够显著降低ROS的含量(P0.05);中、高BE组与BAI组均能够显著降低MDA的含量(P0.05);低、中、高剂量BE组与BAI组均能够显著提高SOD和CAT的活性(P0.05)。2.3BE对IPEC-J2细胞Nrf2蛋白表达量的影响(见图3)由图3可知,与对照组比,H2O2组中H2O2刺激IPEC-J2细胞后,胞浆Nrf2蛋白表达量显著升高(P0.05);胞核Nrf2蛋白表达量显著升高(P0.05)。免疫荧光的结果显示,H2O2刺激会使细胞核中的Nrf2蛋白明显增多。与H2O2组相比,中剂量BE组中IPEC-J2细胞中胞浆Nrf2蛋白的表达量显著升高(P0.05);BE组与黄芩苷组中IPEC-J2细胞的胞核Nrf2蛋白的表达量均显著升高(P0.05),免疫荧光的结果也呈现相同趋势。图3BE对H2O2刺激的IPEC-J2细胞中Nrf2蛋白表达量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F3a1(a)H2O2刺激的IPEC-J2细胞胞浆与胞核Nrf2蛋白免疫印迹10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F3a2(b)BE对IPEC-J2细胞胞浆Nrf2的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F3a3(c)BE对IPEC-J2细胞胞核Nrf2的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F3a4(d)IPEC-J2细胞Nrf2蛋白的分布2.4BE对IPEC-J2细胞抗氧化酶mRNA及蛋白的影响(见图4)由图4可知,与对照组比,H2O2组中HO-1 mRNA的表达量显著升高(P0.05);HO-1的蛋白表达量也显著升高(P0.05);NQO-1 mRNA的表达量显著降低(P0.05)。与H2O2组相比,BE组中HO-1 mRNA和HO-1蛋白的表达与NQO-1 mRNA的表达量均显著升高(P0.05);BAI组中HO-1 mRNA和NQO-1 mRNA的表达量均显著提升(P0.05);低、中、高剂量BE组以及BAI组中HO-1蛋白的表达量均显著提高(P0.05)。图4BE对H2O2刺激的IPEC-J2细胞中HO-1和NQO-1蛋白及mRNA的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F4a1(a)BE对IPEC-J2细胞HO-1 mRNA表达的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F4a2(b)BE对IPEC-J2细胞NQO-1 mRNA表达的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F4a3(c)BE对IPEC-J2细胞HO-1蛋白免疫印迹的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.012.F4a4(d)BE对IPEC-J2细胞HO-1蛋白表达量的影响3讨论氧化应激是体内氧化失衡的结果,导致细胞氧化损伤,或引起细胞死亡[6],其主要原因是氧化自由基以及ROS的大量产生[11]。在机体健康的状态下,组织中的ROS和抗氧化酶相互制约,使组织处于一种平衡状态[12],当生物体内ROS增加,抗氧化酶的活性或表达量降低时,会打破这一平衡,使组织发生氧化应激。SOD是氧化应激中一种较重要的抗氧化酶[13],它的大量产生可以避免氧化应激反应的发生。CAT在保护不同类型细胞免受过氧化氢的侵害中起到核心作用[14]。以上两种抗氧化酶在维持细胞进行正常氧化还原平衡中起重要作用。生物体内,脂质也会发生过氧化反应导致丙二醛(MDA)的大量产生,MDA可以作为一种生物标志物来检测氧化应激是否发生[15]。H2O2可以通过水通道蛋白进入细胞膜扩散[16],当其浓度在生理范围10 nmol/L内时,毒性可大大降低[17]。H2O2刺激细胞后会产生过量的ROS,引起氧化应激和细胞损伤[18]。本试验中,H2O2刺激显著降低IPEC-J2细胞的活力,但BE预处理后可以显著提高IPEC-J2细胞的活力,中剂量BE促进了IPEC-J2细胞的增殖。H2O2刺激能够提高IPEC-J2细胞中的ROS和MDA的水平,显著降低IPEC-J2细胞中CAT和SOD的活性,表明IPEC-J2细胞发生了氧化应激。当BE浓度低于40 mmol/L时,IPEC-J2细胞预处理是安全的,并且增强细胞活力。BE预处理能够降低IPEC-J2细胞中ROS与MDA的含量,增强CAT和SOD活性,表明BE提高了IPEC-J2细胞抗氧化酶的活性,抑制了H2O2诱导的氧化应激。核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)信号通路具有抗氧化作用,在协调细胞对氧化应激的反应中起关键作用[19]。Nrf2是一种转录调节因子,与Keap1结合[20]。氧化应激发生后,Keap1被修饰导致Nrf2的释放与被磷酸化,Nrf2磷酸化后进入细胞核。Nrf2的磷酸化在抗氧化应激中起主要的作用[21],可以促进下游抗氧化基因(HO-1、NQO-1)表达的升高[22-23]。本试验中,H2O2刺激细胞后发现胞浆与胞核Nrf2蛋白表达升高,HO-1、NQO-1 mRNA水平升高,HO-1蛋白水平升高,说明H2O2激活了Nrf2信号通路,并且下游中的抗氧化基因与抗氧化蛋白的表达也升高。与H2O2模型组相比,BE预处理后IPEC-J2细胞中核Nrf2的蛋白表达显著增加,抗氧化物酶的表达升高,活性氧的表达降低,由此可以得出BE能够通过激活Nrf2信号通路减轻H2O2诱导IPEC-J2细胞的氧化应激。Bao等[24]研究表明,BAI可以抑制由LPS诱导引起的氧化应激,通过激活Nrf2及其下游HO-1蛋白的表达发挥作用。BAI经酯化修饰后,其抗氧化活性会发生变化[25]。但本文中同相同物质的量浓度的BE和BAI(20 mmol/L)处理IPEC-J2细胞后,胞核中Nrf2蛋白的表达量、抗氧化酶SOD、CAT的酶活性等关键指标,均未表现出显著差异,表明本文由黄芩苷制备成的BE对IPEC-J2细胞的抗氧化能力未发生显著变化。4结论在H2O2诱导的IPEC-J2细胞氧化应激模型中,BE能够通过促进Nrf2蛋白的入核发挥抗氧化作用,还能够激活抗氧化酶的活性发挥抗氧化作用,其中高剂量的BE效果最好。
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