甘草又称甜草、甜根子，豆科多年生草本植物，为一种广泛使用的中药。甘草根及根状茎粗壮，呈圆柱形，气微，味甜而特殊，药性温和，常用于补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、调和药性[1]。甘草多生长在干旱、半干旱的沙土、沙漠边缘及黄土丘陵地带，在亚洲、欧洲、美洲等地均有分布，在我国主要分布于新疆、内蒙古、甘肃、宁夏等地[2]。甘草中含有甘草酸、甘草次酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等多种活性成分[3]，具有抗菌、抗病毒、抗过敏、抗氧化、抗衰老和免疫调节等作用，被广泛用于治疗呼吸系统、消化系统、内分泌系统及神经系统等多种疾病。饲料中添加甘草及其提取物可提高畜禽的生长性能。以甘草茎叶代替苜蓿饲喂奶牛能够改善其瘤胃发酵参数，提高饲料利用率[4]。饲料中添加甘草粉可提高尖吻鲈肠道消化酶活性，减少肝中过氧化物积累[5]。乌苏里貉饲粮中添加甘草提取物可获得较好的生产性能和毛皮质量[6]。甘草多糖可有效促进断奶仔猪采食，改善血液生理生化指标，提高机体免疫功能和抗氧化能力[7]。甘草酸能够明显缓解黄羽肉仔鸡的炎性反应和免疫应激，发挥免疫调节和抗炎作用[8]。日粮中添加甘草次酸可改善滩羊血清抗氧化功能，增加日增重[9]。我国每年的甘草药渣产量高，其无污染处理和高值化利用逐渐成为研究热点。有报道以甘草渣为原料，与去离子水混合进行水热炭化，并用化学活性剂活化制备活性炭[10]。解先利[11]以甘草渣为原料，同步糖化发酵生产燃料乙醇。还有研究采用固态发酵技术预处理甘草药渣，使用低共熔溶剂提取甘草黄酮[12]。本研究以甘草药渣为原料，采用菌酶协同发酵的方式生产蛋白饲料，通过单因素和响应面优化确定最佳发酵工艺，开发新型中药渣蛋白饲料，拓宽甘草药渣资源化利用途径。1材料与方法1.1菌种和试剂产朊假丝酵母（Candida utilis），YC2-39，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，经过徐州市现代生物技术工程技术研究中心诱变驯化得到的耐高温菌，再经过培养浓缩，冷冻干燥制成活菌总数≥108 CFU/g的菌粉。甘草药渣为徐州市生物制药与废弃物综合利用工程技术研究中心甘草提取后剩下的药渣，烘干，粉碎，过40目筛。木聚糖酶（10 万U/g）、纤维素酶（5 万U/g）购自广东康达生物科技有限公司。1.2仪器设备LDZM-40KCS高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司），SW-CJ-1D超净工作台（苏州净化设备有限公司），HPX-9052MBE恒温培养箱（上海博讯实业有限公司），PHSJ-4A数显pH计（上海雷磁仪器厂）。1.3单因素优化试验1.3.1产朊假丝酵母用量取甘草药渣粉末，按照料液比0.63 g/mL加水拌料混匀，调整初始pH值为5.0，装入烧杯使料层厚度为5 cm，使用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.05%的木聚糖酶、0.2%纤维素酶，分别接入2%、4%、6%、8%、10%的产朊假丝酵母，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.3.2纤维素酶用量取甘草药渣粉末，按照料液比0.63 g/mL加水拌料混匀，调整初始pH值为5.0，装入烧杯使料层厚度为5 cm，用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.05%木聚糖酶、4%产朊假丝酵母，分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%纤维素酶，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.3.3木聚糖酶用量取甘草药渣粉末，按照料液比0.63 g/mL加水拌料混匀，调整初始pH值5.0，装入烧杯使料层厚度为5 cm，用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.2%纤维素酶、4%产朊假丝酵母，分别加入0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%木聚糖酶，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.3.4料液比取甘草药渣粉末，调整料液比分别为0.56、0.63、0.71、0.83、1.00 g/mL，加水拌料混匀，调整初始pH值5.0，装入烧杯使料层厚度为5 cm，用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.2%纤维素酶、0.05%木聚糖酶、4%产朊假丝酵母，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.3.5初始pH值取甘草药渣粉末，按照料液比0.63 g/mL加水拌料混匀，调整初始pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，装入烧杯使料层厚度为5 cm，用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.2%纤维素酶、0.05%木聚糖酶、4%的产朊假丝酵母，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.3.6料层厚度取甘草药渣粉末，按照料液比0.63 g/mL加水拌料混匀，调整初始pH值分别为5.0，装入烧杯使料层厚度分别为3、5、7、9、11 cm，用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.2%的纤维素酶、0.05%木聚糖酶、4%的产朊假丝酵母，搅拌均匀，于35 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.3.7发酵温度取甘草药渣粉末，按照料液比0.63 g/mL加水拌料混匀，调整初始pH值5.0，装入烧杯使料层厚度为5 cm，用8层纱布覆盖烧杯口，包扎，121 ℃灭菌30 min。冷却至室温后，在超净工作台内加入0.2%纤维素酶、0.05%木聚糖酶、4%产朊假丝酵母，搅拌均匀，分别置于30、33、35、37、39 ℃恒温培养5 d，每24 h翻料一次，测定粗蛋白含量。1.4响应面优化试验依据单因素优化结果，以粗蛋白含量为指标，对产朊假丝酵母用量（A）、纤维素酶用量（B）、木聚糖酶用量（C）进行Box-Behnken响应面优化，响应面试验因素与水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.T001表1响应面试验因素与水平设计水平A产朊假丝酵母用量B纤维素酶用量C木聚糖酶用量-160.20.03080.30.051100.40.07%1.5营养成分含量测定按照GB/T 6432—2018测定粗蛋白含量，参考NY/T 3494—2019测定纤维素、半纤维素、木质素含量，GB 5009.4—2016测定粗灰分的含量。1.6数据处理与分析每组试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。采用Design-Expert 13.0软件进行试验设计与分析，采用Origin 2021软件进行绘图。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1产朊假丝酵母用量对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，产朊假丝酵母用量为2%~10%时，粗蛋白含量随其增加呈先上升再下降趋势，较大的接种量有助于菌种生长，接种量过大会由于营养物质过度消耗而早衰。产朊假丝酵母用量为8%时，粗蛋白含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F001图1产朊假丝酵母用量对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.1.2纤维素酶用量对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图2）纤维素酶将甘草纤维素降解成寡糖或单糖，利于产朊假丝酵母生长繁殖。由图2可知，纤维素酶用量为0.1%~0.3%时，甘草渣粗蛋白含量随其增加迅速升高；在0.3%~0.5%时，粗蛋白含量保持稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F002图2纤维素酶用量对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.1.3木聚糖酶用量对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图3）木聚糖酶可以破坏甘草的细胞壁，将木聚糖降解为低聚木糖或木糖。由图3可知，产朊假丝酵母YC2-39具有利用木糖的能力。木聚糖酶用量在0.01%~0.05%范围内，甘草药渣粗蛋白含量增加较快；木聚糖酶用量超过0.05%时，粗蛋白含量保持稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F003图3木聚糖酶用量对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.1.4料液比对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图4）产朊假丝酵母生长繁殖需要水分，纤维素酶、木聚糖酶的作用也需要水分。由图4可知，料液比在0.56~1.00 g/mL范围内时，甘草药渣粗蛋白含量先上升后下降，料液比为0.71 g/mL时，粗蛋白含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F004图4料液比对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.1.5初始pH值对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图5）产朊假丝酵母生长、纤维素酶酶活、木聚糖酶酶活均受pH值影响。由图5可知，较适pH值范围为4.0~6.0。初始pH值为4.0~6.0时，甘草渣粗蛋白含量先增加再减少；初始pH值为5.0时，粗蛋白含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F005图5初始pH对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.1.6料层厚度对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图6）产朊假丝酵母YC2-39在有氧和部分缺氧的情况下均可生长。由图6可知，料层厚度对甘草药渣粗蛋白含量无明显影响，随着料层厚度增加，粗蛋白含量略有降低。综合考虑，选择料层厚度为7 cm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F006图6料层厚度对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.1.7发酵温度对甘草药渣粗蛋白含量的影响（见图7）由图7可知，在一定范围内，酶的活性和产朊假丝酵母的生长速率随着温度升高而增高，温度过高会导致酶失活，酵母早衰。发酵温度为31~39 ℃时，甘草药渣粗蛋白含量随着温度升高先升高后略有降低，升降幅度不显著。在37 ℃下发酵，粗蛋白含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F007图7发酵温度对甘草药渣粗蛋白含量的影响2.2响应面优化结果单因素试验显示产朊假丝酵母用量、纤维素酶用量、木聚糖酶用量对粗蛋白含量影响较大，其他因素影响较小。根据单因素试验结果，选择料液比0.71 g/mL、初始pH值5.0、料层厚度7 cm、发酵温度37 ℃，以粗蛋白含量为目标，响应面优化产朊假丝酵母用量、纤维素酶用量、木聚糖酶用量。响应面试验设计及结果见表2，响应面回归模型方差分析见表3。各因素交互作用对甘草药渣粗蛋白含量的影响见图8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.T002表2响应面试验设计及结果试验号ABC粗蛋白含量（R）160.30.0725.78280.40.0722.08380.30.0526.40480.20.0725.37580.30.0525.86660.40.0525.08780.40.0325.58880.30.0526.409100.30.0721.671080.20.0320.581160.20.0521.251280.30.0524.401360.30.0321.561480.30.0525.7815100.20.0523.7016100.40.0522.5717100.30.0324.61%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.T003表3响应面回归模型方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值总和63.820 016模型60.900 096.770 016.190 00.000 7A0.156 810.156 80.375 10.559 6B2.430 012.430 05.820 00.046 7C0.825 610.825 61.970 00.202 7AB6.150 016.150 014.710 00.006 4AC12.820 0112.820 030.660 00.000 9BC17.180 0117.180 041.100 00.000 4A27.200 017.200 017.220 00.004 3B27.230 017.230 017.290 00.004 3C24.690 014.690 011.220 00.012 3残差2.930 070.418 1失拟项0.247 530.082 50.123 20.941 6纯误差2.680 040.669 7注：1.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.R2=0.954 1，R2Adj=0.895 2，R2pred=0.872 4，信噪比10.7088。图8各因素交互作用对甘草药渣粗蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F8a1（a）产朊假丝酵母用量与纤维素酶用量对粗蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F8a2（b）产朊假丝酵母用量与木聚糖酶用量对粗蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.F8a3（c）纤维素酶用量与木聚糖酶用量对粗蛋白含量的影响以甘草药渣粗蛋白含量为响应值，利用Design-Expert 13.0软件分析得到的回归方程为：R=25.770 0-0.140 0A+0.551 3B+0.321 3C-1.240 0AB-1.790 0AC-2.070 0BC-1.310 0A2-1.310 0B2-1.060 0C2。由表3可知，模型极显著（P0.01），失拟项不显著（P0.05），该模型能够比较准确地模拟产朊假丝酵母用量、纤维素酶用量、木聚糖酶用量之间的关系；R2=0.954 1，R2Adj=0.895 2，表明试验所得值与预测值相关性高，模型拟合度良好。交互项AB、BC、AC，二次项A2、B2均对结果影响极显著（P0.01），一次项B、二次项C2对结果影响显著（P0.05）。各因素对甘草药渣粗蛋白含量的影响排序为纤维素酶用量＞木聚糖酶用量＞产朊假丝酵母用量。回归模型确定的各因素最佳用量为产朊假丝酵母7.360%、纤维素酶0.310%、木聚糖酶0.056%，预测得到的粗蛋白含量为25.870%。按照预测用量进行3次重复试验，粗蛋白平均含量为25.65%，和预测结果基本一致。2.3甘草药渣的营养成分含量变化（见表4）由表4可知，甘草药渣粗蛋白含量由发酵前的12.29%增长至25.65%，提高了13.36%；纤维素含量由发酵前的43.46%减少至28.13%，降低了15.33%；半纤维素含量由发酵前的10.24%减少至7.92%，降低了2.32%；木质素含量由发酵前的14.73%减少至11.28%，降低了3.45%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.016.T004表4甘草药渣的营养成分含量项目发酵前甘草药渣发酵后甘草药渣粗蛋白12.2925.65纤维素43.4628.13半纤维素10.247.92木质素14.7311.28灰分7.327.55%3讨论3.1非常规蛋白饲料发酵微生物的选择微生物发酵是制备非常规蛋白饲料的重要方法。梅华迪等[13]优化了黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌混菌发酵柑橘渣生产蛋白饲料的工艺条件。结果显示，在最佳工艺条件下，粗蛋白含量为18.72%，比发酵前提高了60.41%。张海静[14]采用黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉多种菌固态发酵挤压酱油渣，发酵后真蛋白含量达到32.17%，明显高于发酵前。郑秋桦等[15]优化了黑曲霉、枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母混菌发酵金针菇食用菌渣生产蛋白饲料的工艺，发酵后粗蛋白含量为22.37%，是发酵前的2.11倍。上述研究表明，假丝酵母为菌体蛋白发酵的主要微生物，本研究选育了能够利用五碳糖和六碳糖的高产蛋白的耐高温产朊假丝酵母YC2-39作为发酵甘草药渣的菌种。3.2菌酶协同发酵甘草药渣粗蛋白含量的影响菌酶协同发酵可高效降解饲料原料，提高营养物质含量[16]，从而提高动物的生长性能[17]。王乐乐等[18]筛选得到4种发酵香菇菌糠的菌酶复合制剂，显著改善了菌糠饲料品质。陈敬帮等[19]采用菌酶协同发酵豆粕，实现了同时去除大部分抗营养因子。甘草药渣中含有大量纤维素、半纤维素和木质素，本研究结果表明，产朊假丝酵母与纤维素酶、产朊假丝酵母与木聚糖酶、纤维素酶与木聚糖酶交互作用均显著，纤维素酶和木聚糖酶将产朊假丝酵母YC2-39无法直接利用的多糖转化为可利用的低聚糖或寡糖，显著提高了甘草药渣粗蛋白的含量。4结论本试验结果表明，各因素对甘草药渣粗蛋白含量的影响由大到小依次为：纤维素酶用量木聚糖酶用量产朊假丝酵母用量，且产朊假丝酵母与纤维素酶、产朊假丝酵母与木聚糖酶、纤维素酶与木聚糖酶交互作用均为显著。响应面优化确定产朊假丝酵母用量7.360%、纤维素酶用量0.310%、木聚糖酶用量0.056%。在最佳发酵工艺条件下，甘草药渣粗蛋白含量为25.65%。发酵后甘草药渣粗蛋白含量提高了13.36%；纤维素、半纤维素、木质素含量分别降低了15.33%、2.32%、3.45%。菌酶协同发酵甘草药渣，可实现甘草药渣的饲料化利用。