我国每年生产白酒产生的酒糟达近千万吨。废弃酒糟量大且集中会造成浪费资源，同时污染环境。拓宽酒糟的利用率、提高其附加值势在必行[1-2]。目前，酒糟主要用作饲料[3-5]和燃料[6-8]。酒糟含有丰富的有机质，分解、腐熟后与相关微生物配伍制作成生物有机肥，肥效甚佳[9-12]。将酒糟采用发酵法生产有机肥，可以从根本上解决酒糟污染的问题，具有广阔的市场前景。酒糟是由小麦、高粱、大米、玉米和薯类等为原料蒸馏后剩下的白酒主要副产物[13-14]，含有粗蛋白质、粗纤维、粗淀粉和有机酸等物质[15-17]。因此，酒糟的酒精度和酸度高、粗纤维含量也较大，出现腐熟不彻底、腐熟周期长等问题。酒糟制备成酒糟有机肥后施用于土壤中会进行二次发酵，形成农作物“烧根”现象。目前，针对酒糟的处理方式主要是微生物降解。而市售的腐熟菌剂种类并不丰富，且大多不适用于酒糟这种特殊的环境，导致其腐熟降解效果大大降低[18-20]。因此，有必要从酒糟中筛选出具有产纤维素酶能力的优势菌株，丰富降解酒糟的菌株种类，提高酒糟的降解效果，为白酒酒糟专用腐熟菌剂的应用提供参考。研究采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基，从酒糟中初步筛选出一批菌株，利用刚果红培养基复筛出透明圈直径较大的菌株，通过生理生化试验对筛选出的菌株进行鉴定，分别以羧甲基纤维素钠、微晶纤维素和水杨苷为底物，采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定菌株的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，采用形态学及分子生物学对筛选出的优势菌株进行鉴定，并利用MEGA6.0软件构建系统发育树，通过测定不同温度和pH值下的酶活来探究菌株P-7的酶学性质。1材料与方法1.1试验材料1.1.1材料处理采用五点取样法，分别取10 g酒糟、窖泥。酒糟和窖泥1∶1的混合物加入装有90 mL 0.9%生理盐水的锥形瓶中，在30 ℃、180 r/min的条件下振荡30 min，静置分层，取上清液备用。1.1.2培养基富集培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5.0 g、磷酸氢二钠（十二水）1.6 g、七水硫酸镁0.5 g、磷酸氢二钾0.9 g、硝酸钾1.0 g、氯化钾0.5 g、酵母粉0.5 g、蛋白胨0.5 g、蒸馏水1.0 L。选择培养基：CMC-Na 10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、七水硫酸镁0.2 g、氯化钠10.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1.0 L。CMC刚果红培养基：磷酸氢二钾0.50 g、硫酸铵2.00 g、七水硫酸镁0.25 g、微晶纤维素粉1.88 g、刚果红0.20 g、琼脂20.00 g、蒸馏水1.00 L。发酵培养基：CMC-Na 10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、七水硫酸镁0.2 g、氯化钠10.0 g、蒸馏水1.0 L。1.1.3试剂刚果红、氯化钠、醋酸钠、氢氧化钠、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、水杨苷、3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、蔗糖、淀粉、乳糖、琼脂均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；醋酸、过氧化氢均为生化试剂，购自成都市科龙化工试剂厂；细菌基因组DNA快速提取试剂盒和PCR产物纯化回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。1.1.4仪器控温摇床购自艾卡（广州）仪器设备有限公司；超净工作台购自常州普天仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；多功能PCR仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；离心机购自北京大龙兴创试验仪器有限公司；凝胶成像系统购自美国Gel Doc XR+公司；电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；恒温磁力搅拌器购自金坛市医疗仪器厂；恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司。1.2试验方法1.2.1产纤维素酶菌株的分离纯化吸取10 mL 1.1.1预处理后的上清液加入装有90 mL富集培养液的锥形瓶中，在180 r/min、30 ℃的条件下培养24 h。从富集培养液中吸取100 μL上层富集液放入2 mL Ep管，加入900 μL无菌水，摇匀，再稀释至10-4、10-5、10-6倍，吸取60 μL 3种倍数的稀释液在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基上进行涂布，倒置，30 ℃培养2 d。挑取平板上不同形态的单个菌落，在选择培养基上进行分离纯化，倒置，30 ℃培养2~4 d。重复此步骤直至每种菌为纯菌落。1.2.2产纤维素酶菌株的筛选挑取单个菌落，点接至选择培养基，30 ℃培养2 d。待培养基上长出大小均匀的菌斑，倒入1 mg/mL刚果红染液染色10 min，倒出染液，加入1 mol/L氯化钠溶液脱色15 min，观察菌落周围有无透明圈，测量其直径。选取透明圈直径较大的菌株点接至刚果红培养基，30 ℃培养2 d，观察菌落周围的水解圈并测量其直径。通过测定水解圈的大小及酶活力（内切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力及β-葡萄糖苷酶活力）初步判定菌株的产纤维素能力。1.2.3菌株生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》的方法对产纤维素酶菌株进行淀粉水解试验、过氧化氢试验、甲基红（M-R）试验、乙酰甲基甲醇试验（V-P）试验、葡萄糖的利用试验、蔗糖和乳糖的利用试验。1.2.4标准曲线的绘制将葡萄糖干燥至恒重，配制成浓度为1 g/L的葡萄糖标准液。向6只干燥的试管中分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的葡萄糖标准液，各加入2.5 mL DNS显色液，混匀后沸水浴10 min，取出并冷却，定容至总体积为25 mL，在540 nm处测定吸光度值。1.2.5酶液的制备从平板上挑取单个菌落转接至8 mL液体培养基，在30 ℃、180 r/min条件下过夜培养，再按5%接种量接种至8 mL液体培养基，相同条件过夜培养。吸取2 mL培养好的菌液至EP管，4 ℃、1 000 ×g离心5 min，上清液即为待测酶液。1.2.6酶活的测定分别以羧甲基纤维素钠溶液、微晶纤维素溶液和水杨苷溶液为底物，采用DNS法测定菌液的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活。向试管中加入0.2 mL酶溶液，在50℃的水浴锅中预热2 min，以沸水浴煮沸并紫外灭活后的菌液作为空白对照，分别加入1 mL已预热至50℃的1 %羧甲基纤维素钠溶液、微晶纤维素溶液和水杨苷溶液并混匀，50℃水浴10 min，加入2.5 mL DNS显色液，摇匀并沸水浴10 min，流水冷却，并用蒸馏水定容至总体积为25 mL，在540 nm处测定吸光度值。酶活单位（U）定义：在一定条件下，1 min内分解底物产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量[21]。1.2.7酶活的计算公式酶活(U/mL)=C×V×1 000180v×t (1)式中：C为根据吸光度值计算出的溶液质量浓度（mg/mL）；V为反应总体积（mL）；180为葡萄糖的分子量；v表示供试品溶液体积（mL）；t为反应总时间（min）。1.2.8菌株形态学鉴定（1）菌落培养特征。将稀释后的菌液涂布在筛选培养基上，30 ℃培养2~3 d，观察菌落形态、颜色、大小、表面隆起和透明度。（2）革兰氏染色。采用革兰氏染色法对菌株进行染色，利用显微镜观察菌株细胞的形态及繁殖方式。1.2.9分子生物学鉴定采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株的基因组，以此基因组为模板，使用细菌通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',1492R：5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rDNA序列。PCR条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s（30个循环），72 ℃ 5 min，4 ℃保存。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，将得到的测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）上进行核苷酸序列同源性比较，并从数据库中获得相关属性的16S rDNA序列，采用MEGA6软件构建系统发育树。1.2.10菌株P-7的酶学性质探究1.2.10.1温度对菌株P-7酶活的影响将0.2 mL待测酶液与提前在50 ℃条件下预热2 min的1 mL 1 % CMC-Na充分混合后，分别在35、40、45、50、55、60、65 ℃条件下水浴30 min，加入2.5 ml DNS试剂，充分混匀并沸水浴10 min，加蒸馏水定容至总体积为25 mL，在540 nm处测定吸光度并确定最适反应温度。1.2.10.2pH值对菌株P-7酶活的影响分别用pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0醋酸-醋酸钠缓冲液配制1 % CMC-Na底物。取1 mL不同pH值的1 % CMC-Na（提前在50 ℃条件下预热2 min）与0.2 mL待测酶液充分混合，50 ℃水浴反应30 min，加入2.5 mL DNS试剂，充分混匀并沸水浴10 min，加蒸馏水定容至总体积为25 mL，在540 nm处测定吸光度并确定最适反应pH值。1.3数据统计与分析采用Origin 2018软件绘制图表，SPSS 20软件进行相关性分析。2结果与分析2.1产纤维素菌株的筛选（见表1）通过刚果红透明圈直径与菌落直径比（D/d）筛选得到15株透明圈直径比较大的菌株。由表1可知，从酒糟中筛选得到的菌株刚果红透明圈直径均大于从窖泥中筛选得到的菌株刚果红透明圈直径，其中从窖泥中筛选得到的编号为N-8的菌株刚果红透明圈直径与菌落直径的比值最大为26 mm，从酒糟中筛选得到的编号为P-7菌株的刚果红透明圈直径与菌落直径的比值最大为44 mm，仅次于商业菌株里氏木霉（CICC 41027）的刚果红透明圈直径与菌落直径的比值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.T001表1菌株的刚果红透明圈菌株编号菌落直径d/mm透明圈直径D/mm比值N-712222.0N-812626.0N-8'22914.5N-912525.0N-1212222.0N-1422412.0N-1722512.5N-1822412.0P-122010.0P-714444.0P-913737.0P-1423115.5P-1713030.0P-1812828.0P-1922613.0芽孢杆菌13030.0里氏木霉15555.0注：N为从窖泥中筛选出的菌株，P为从酒糟中筛出的菌株。2.2生理生化鉴定（见表2）由表2可知，编号为N-8、N-8'、P-1、P-7、P-9和P-19菌株的淀粉水解试验、过氧化氢试验、M-R试验、V-P试验、葡萄糖的利用试验、蔗糖和乳糖的利用试验均为阳性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.T002表2菌株的生理生化特征菌株编号淀粉水解试验过氧化氢酶试验M-R试验V-P试验葡萄糖利用试验蔗糖利用试验乳糖利用试验N-7++-++++N-8+++++++N-8'+++++++N-9+-+-+++N-12-++-+++N-14+++-+++N-17+++-+++N-18+++-+++P-1+++++++P-7+++++++P-9+++++++P-14+++-+++P-17++--+++P-18+++-+++P-19+++++++芽孢杆菌+++-+++里氏木霉+-+-+++注：+表示阳性结果；-表示阴性结果。2.3葡萄糖标准曲线（见图1）3，5-二硝基水杨酸溶液与葡萄糖标准液共沸后被还原成棕红色的氨基化合物。在一定范围内，葡萄糖标准液的量与棕红色化合物的颜色深浅成一定的比例关系。因此，在540 nm下测定棕红色物质的吸光度，按照标准曲线公式可求出样品中葡萄糖含量。由图1可知，葡萄糖标准曲线的线性关系为y=0.531 6x-0.021，R2=0.990 5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F001图1葡萄糖标准曲线2.4酶活的测定（见图2）由于菌圈大小和菌苔厚度的影响，刚果红透明圈大小并不能准确反映菌株的产纤维素能力，因此需要对刚果红透明圈筛选后的菌株进行3种酶活力的测定，从而进一步对菌株进行筛选。由图2可知，通过刚果红透明圈筛选出15株菌株，其中从窖泥中筛选得到的编号为N-7的菌株外切葡聚糖酶活最高，为2.21 U/mL，而其β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶的酶活并不高，分别为0.25 U/mL和0.38 U/mL；从酒糟中筛选得到的编号为P-7的菌株内切葡聚糖酶酶活最高，达到了2.66 U/mL，是商业芽孢杆菌的3.97倍，其外切酶活力和β-葡萄糖苷酶活力均不高，分别为0.60 U/mL和0.25 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F002图2菌株的3种酶活力2.5目的菌株的形态学特征（见图3）图3编号P-7菌株的形态学特征10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F003（a）编号P-7的菌落形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F004（b）编号P-7的革兰氏染色镜检10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F005（c）编号P-7的刚果红透明圈由图3（a）可知，菌落呈圆形、边缘锯齿状、表面光滑、有凸起、菌株外部呈乳白色、凸起内部颜色透明、状态黏稠；革兰氏染色为阳性菌。由图3（b）可知，菌株为杆状，芽孢形态为卵圆形。由图3（c）可知，编号为P-7的菌株刚果红透明圈，直径为44 mm。2.6菌株P-7的分子生物学鉴定2.6.1菌株P-7基因组DNA提取（见图4）由图4可知，采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒对菌株P-7的基因组DNA进行提取，利用通用引物27F和1 492R对目的菌株P-7的基因组DNA进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在2 000 bp和1 000 bp处有1条明显的条带，表明PCR扩增效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F006图4P-7的PCR扩增产物注：1为DNA Marker 2000；2为PCR产物。2.6.2菌株P-7的16S rDNA测序（见图5）将P-7基因组DNA的PCR产物测序鉴定结果表明，该序列全长1 417 bp，在NCBI进行Blast比对后，选择第一个同源性最高的已登录号，通过MEGA6.0软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树。由图5可知，菌株P-7与菌株Bacillus sp. strain （MH 769169.1）和Bacillus velezensis strain（MK 629006.1）最接近，相似度达到100%，再结合其生理生化特征和菌落形态，表明菌株P-7为维氏芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F007图5菌株P-7的系统发育树2.7菌株P-7的酶学性质探究2.7.1温度对菌株P-7酶活的影响（见图6）由图6可知，随着温度的升高，菌株P-7的酶活也逐渐升高；当温度达到55 ℃时，P-7的酶活达到峰值（2.696 U/mL）。当温度继续上升时，P-7的酶活下降趋势显著。低温会抑制菌株P-7的酶活，高温则会导致菌株P-7的酶变性，使得酶活性降低[22]。因此，菌株P-7的最适温度为50~55 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F008图6温度对菌株P-7酶活的影响2.7.2pH值对菌株P-7酶活的影响（见图7）由图7可知，菌株P-7的酶活在pH值3.5时最低（0.354 U/mL），可能由于氢离子浓度较大而导致纤维素酶严重失活[23-24]。当pH值升高时，菌株P-7的酶活随着底物pH值的升高而急剧增加，这可能因为菌株P-7所产的酶在不同的氢离子浓度下解离不同。当pH值5.5时，菌株P-7的酶活达到最大值（2.621 U/mL）；而当pH值继续增加时，P-7酶活呈缓慢下降趋势。因此，菌株P-7的最适范围为pH值5.0~5.5。Yang等[25]分离得到1株纤维素酶活性高的新菌株（2.82 U/mL），该菌株在60 ℃和pH值6.0下产生的纤维素酶活性最高，Yin等[26]等构建的工程菌酶活在pH值8.5才达到最佳酶活性。对比可知，菌株P-7具有良好的耐酸性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.001.F009图7pH值对菌株P-7酶活的影响3结论采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基从酒糟中筛选产纤维素能力的菌株，通过刚果红培养基筛选得到15株具有产纤维素酶能力的菌株，经过生理生化和内切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力筛选后得到一株编号为P-7的菌株，其内切酶活力为2.66 U/mL，外切酶活力为0.60 U/mL和β-葡萄糖苷酶活力为0.25 U/mL。通过分子生物学鉴定，再结合其生理生化特征和菌落形态，表明菌株P-7为维氏芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain）。通过酶学性质探究可知，菌株P-7的最适温度为50~55 ℃，最适pH值5.0~5.5，具有良好的耐酸性，为白酒酒糟专用腐熟菌剂的进一步研究提供参考。