酵母制剂是由酿酒酵母发酵产生的一种新型的饲料添加剂。酵母产品存在应用效果不突出、效果不稳定和重复性差等问题，菌种及日粮组成可能是导致不同产品效果差异的主要原因之一[1]。因此，明确不同种类产品的应用效果，对其合理应用具有重要意义。研究采用体外产气量技术，在高精料（精粗比70∶30）发酵条件下评价市场上使用较为普遍的2种活性干酵母制剂，为日后的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料活性干酵母（ADY）分别为福邦活性干酵母（购自安琪酵母股份有限公司活菌数≥20×1010 CFU/g）和拉曼活性干酵母（购自拉曼动物营养公司，菌种为CNCMI-1077，乳白色球状颗粒，活菌数≥0.8×1010 CFU/g）。包被的活性酵母制剂在使用3 h前放入蒸馏水中，在振荡培养箱活化，利用四层纱布过滤外皮，留下的滤液经稀释后用血细胞计数板计数法进行计数，并计算滤液中酵母菌浓度后待用，添加剂量及方法参考耿春银等[1]的方法。发酵底物全价TMR饲料（精粗比70∶30），基础日粮组成及营养水平见表1。发酵底物经干燥，粉碎至80目备用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.002.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米秸秆30.0生长净能/(MJ/kg)4.69玉米56.0粗蛋白/%12.52大豆粕12.2粗纤维/%12.35食盐0.5中性洗涤纤维/%16.10石粉0.8酸性洗涤纤维/%27.87预混料0.5粗脂肪/%2.99粗灰分/%4.07钙/%0.68磷/%0.31注：预混料购自禾丰饲料有限公司。1.2试验动物及饲养管理选取3头安装永久性瘤胃瘘管的成年健康延边黄牛。在试验前2周预饲基础饲粮（组成同表1），早晚各饲1次，自由饮水。1.3试验方法1.3.1试验设计试验采用单因素试验设计，设置不添加底物的空白组及处理组，每组6个平行。对照组（CON）添加220 mg基础日粮（80目）作为发酵底物；T1组在基础日粮（220 mg）中添加约为2.4×106 CFU的活性福邦酵母；T2组在基础日粮（220 mg）中添加2.4×106 CFU的活性拉曼酵母。1.3.2瘤胃液体外发酵体外发酵参考Menke等[2]的试验步骤进行。晨饲前采集瘤胃液样品放入经39 ℃预热的保温杯带回实验室，在实验室的39 ℃水浴锅中利用四层纱布过滤，滤液倒入配置好的人工瘤胃营养液中（体积比例为1∶2，人工培养液经二氧化碳饱和并预热），制成混合人工瘤胃培养液。混合后的培养液放置在39 ℃恒温水浴锅内并保持二氧化碳的持续通入。用自动分液器向注射器（39 ℃预热）中注入30 mL混合发酵液，其中处理组按照添加剂量注入菌液（T1，20 μL，约含有2.4×106 CFU福邦酵母；T2，100 μL，约含有2.4×106 CFU拉曼酵母），混匀读取刻度后迅速放入针管式水浴振荡培养箱中。1.4测定指标及方法1.4.1净产气量及产气参数培养前12 h每2 h读取1次示数，之后每4 h读取1次并记录。根据公式（1）计算各时间段的净产气量情况。根据France等[3]和Ørskov等[4]提出的产气模型：Y=b×[1-e-(t-L)]和Y=b×[1-e-ct](1)式中：Y为发酵底物在t时间点的产气量（mL）；b为潜在产气量（mL）；c为发酵底物产气速度（mL/h）；t为培养时间（h）；L为产气延滞时间（h）。1.4.248 h发酵气体成分发酵结束后（48 h），取每组的3个平行终止发酵。采用气相色谱仪（型号GC1120，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）对甲烷气体（CH4）的含量进行测定。测定条件：以氮气为保护气，气体流量50 mm/min、进样量1 mL，氢离子火焰检测器柱子型号HP-INNOWax（1 m×3 mm×2 mm）、柱箱温度120 ℃、检测器温度250 ℃、进样口温度220 ℃。1.4.348 h发酵液发酵参数发酵结束后使培养管在冰水浴条件下停止发酵，使用pH值测定仪测定发酵液pH值3次。对发酵液4 500 r/min离心10 min，保留上清液。参考Broderick等[5]的方法测定VFA；参考冯宗慈等[6]的方法测定发酵液中NH3-N含量；参考杨平平等[7]的方法测定乳酸的含量。1.4.4有机物消化率、代谢能值及瘤胃微生物蛋白产量发酵底物的有机物消化率（OMD）、代谢能值（ME）及瘤胃微生物蛋白产量（MCP）可根据产气量进行估测[2]。计算公式如下：OMD＝(14.88+0.889GP+0.45CP+0.651A)×100%(2)ME(MJ/kg)=2.20+0.136GP+0.0574CP(3)式中：GP为24 h的净产气量（mL/200 mg DM）；A为粗灰分含量（%）；CP为粗蛋白质含量（%）。瘤胃微生物蛋白量（MCP）根据每千克（kg）可消化有机物可产生19.3 g微生物氮求得。DOM公式如下:DOM(g/kg OM)=13.3GP-0.05GP2+511CP+76EE+91.2(4)式中：GP为发酵24 h的产气量（mL/200 mg DM）；CP为粗蛋白含量（%）；EE为粗脂肪含量（%）。1.5数据统计与分析试验分析采用SPSS 19.0的GLM模型进行方差分析，并采用LSD法进行多重比较，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1活性酿酒酵母制剂对体外发酵产气量及产气参数的影响（见表2、表3）由表2可知，随着发酵时间的延长时，各组的产气量均呈上升状态，但各组间并无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.002.T002表2活性酿酒酵母制剂对体外发酵产气量的影响 单位：mL发酵时间/hCON组T1组T2组SEMP值28.179.8311.330.690.180423.3321.7025.330.910.294635.0733.1337.831.000.154844.3743.2046.931.140.4481049.1049.0754.101.490.3211254.4352.7758.971.530.2561660.2358.3364.471.690.3632064.6761.4369.001.900.2972468.0064.3372.271.960.2843071.2767.6775.502.070.3443675.3369.2778.832.220.2204877.5073.3081.272.050.320注：同行数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05）；字母相同或无字母标注表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表3可知，各组理论最大产气量与实际产气量相近，各组间无显著差异(P0.05)。酵母制剂组的产气延滞时间数值上小于对照组，但差异均不显著(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.002.T003表3活性酿酒酵母制剂对体外发酵产气参数的影响项目CON组T1组T2组SEMP值理论最大产气量/mL75.1370.3879.152.150.276产气速率/(%/h)0.1150.1210.11700.302产气延滞时间/h0.860.750.580.070.3522.2活性酿酒酵母制剂对体外发酵48 h的发酵参数的影响（见表4、表5）由表4可知，各组的pH值、氨态氮浓度和微生物蛋白数值相近（P0.05）。各试验组的甲烷浓度均低于对照组，无显著差异（P0.05）。与对照组相比，各试验组的乳酸含量均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.002.T004表4活性酿酒酵母制剂对体外发酵参数及微生物蛋白的影响项目CON组T1组T2组SEMP值pH值6.406.416.400.010.758氨态氮/(mg/L)565.60573.70563.705.200.586乳酸/(mg/L)5.70a4.10b4.70b0.200.006甲烷/%15.2713.7912.850.820.491微生物蛋白产量/(g/kg DM)142.58142.12143.130.250.298由表5可知，与对照组相比，各组的挥发性脂肪酸含量及总挥发性脂肪酸含量均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.002.T005表5活性酿酒酵母制剂对体外发酵挥发性脂肪酸的影响项目CON组T1组T2组SEMP值乙酸/%60.2258.7760.530.460.279丙酸/%20.3220.4320.290.130.914异丁酸/%1.681.831.590.750.469丁酸/%11.9512.5911.720.230.325异戊酸/%3.483.813.470.080.170戊酸/%2.352.572.390.080.544乙酸/丙酸2.962.882.990.040.526总挥发酸/(mmol/L)67.6568.6168.761.210.9392.3活性酿酒酵母制剂对体外发酵有机物消化率及代谢能值的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，各组的有机物消化率和代谢能值均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.002.T006表6活性酿酒酵母制剂对有机物消化率、代谢能值的影响项目CON组T1组T2组SEMP值有机物降解率/%83.6280.3587.411.740.284代谢能/(MJ/kg)12.1711.6712.750.270.2863讨论3.1活性酿酒酵母制剂对体外发酵产气量及产气参数的影响反刍动物日粮在发酵体系下代谢产生大量的氨气、甲烷、二氧化碳和氢气[8]。体外产气量可以预见饲料的降解效果和瘤胃液的发酵水平[9]。张政等[10]用体外产气法评价不同种类的活性酵母菌株对瘤胃发酵的影响，发现各试验组的产气量与对照组均无显著差异，但各处理组间存在一定差异。瘤胃细菌数量及产气量的差异可能是不同类型的酵母菌所引起[11]。本试验中，处理组的产气量与对照组之间无显著差异，但是T2活性酵母组的产气量在数值上高于安琪酵母组，这可能是酵母品种不同所致。产气速率是衡量瘤胃发酵活跃程度的指标之一。产气速率与底物成分、微生物数量和活性等因素有关[12]。NDF/CP会影响发酵停滞期和发酵速度（NDF为不易发酵成分，CP为易发酵成分），当NDF/CP过高时，发酵速度较慢。酵母菌在发酵过程中可以分泌各种消化酶来改善饲料纤维及蛋白利用，增加微生物发酵所利用的养分。本研究中，处理组的产气速率在数值上均高于对照组且T1酵母组的数值更高，同时处理组的产气延滞时间均低于对照组且T1组的数值最低，可能是因为T1活性酵母对底物养分利用更充分所致。3.2活性酿酒酵母制剂对体外发酵48 h的发酵参数的影响瘤胃的健康状态可以用pH值大小判断[13]。正常瘤胃的pH值变化范围为6.0~7.0[14]，本试验中，各组pH值均在正常范围内，与高精料下ADY对体外瘤胃pH值影响结论一致[1]。NH3-N浓度过高造成其利用率下降，导致能量损失；NH3-N浓度过低将无法满足机体对菌体蛋白的需求，导致瘤胃发酵速率下降，造成营养物质的浪费[15]。耿春银等[1]研究发现，添加酵母菌能够使NH3-N浓度增加；而Hristov等[16]认为，添加酵母菌未显著改变NH3-N浓度。本试验中，各组的NH3-N浓度无显著差异，与微生物蛋白产量结果一致。饲料中碳水化合物的结构和浓度的改变容易导致酸中毒[17-18]。在精料比例较低时，产生的VFA被瘤胃壁吸收，使乳酸不宜积累[19]。随着精料比例的提高，产生的有机酸不断增加，乳酸利用菌的活动无法满足乳酸的吸收导致乳酸积累进而导致pH值下降。在酸性较高的环境下，瘤胃会改变发酵模式导致饲料的利用率下降[20]。本研究发现，添加ADY后瘤胃乳酸含量均显著下降，可能是因为活性酵母中丰富的氨基酸、B族维生素、有机酸、糖类等营养成分为乳酸利用菌的发酵提供基质，导致其发酵强度增大，加大乳酸的利用[21]。减少甲烷气体的排放不仅可以减少环境问题，更能够增加饲料的利用效率。班志彬等[22]在草原红牛的饲粮中添加200 mg/kg活性酵母，发现甲烷产量下降9.84%。牛建康[23]在泌乳奶牛饲料中添加活性干酵母使甲烷产量下降16.99%。本研究中，TI及T2对甲烷产量均没有显著的影响，但都表现出降低甲烷产量的趋势，可能与酵母制剂的品种和作用浓度有关[13]，原因需进一步探索。VFA是反刍动物重要的能量来源[24-25]。乙酸、丙酸和丁酸的含量可达到VFA的95%[26]。丙酸在糖异生的作用下能够合成单糖；乙酸是乳脂合成的主要前体物质[27]。瘤胃中丙酸比例越高，可供机体利用的能量就越高[28]。酵母菌制剂对瘤胃挥发性脂肪酸的影响结果报道并不一致，可能与日粮组成、酵母制剂类型及品种等因素有关[29]。本试验中，T1和T2对体外瘤胃挥发酸无显著影响。Kowalik等[30]研究发现，ADY对犊牛瘤胃总VFA浓度及个别VFA比例均无显著影响，与本试验结果一致。3.3活性酿酒酵母制剂对体外发酵有机物消化率及代谢能值的影响本试验中，各组的OMD、ME均无显著差异。虽然可以利用OMD、ME等指标对添加剂的使用效果进行预测，但是体内的实际效果和预测效果可能有一定的偏差，因此，有必要进行体内试验。4结论福邦及拉曼2种活性干酵母制剂均可显著降低瘤胃乳酸含量，且二者在对高精料体外瘤胃发酵的影响上并无显著差异。