代谢组学作为后基因组学时代新兴的一门学科，与基因组学、转录组学和蛋白质组学共同构成生物学系统的核心[1]。代谢组学中常见的分析技术包括核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）[2]，其中LC-MS具有灵敏度更高、检测范围广、方法多样化等优点[3]。随着分子技术的快速发展，代谢组学在畜禽繁殖性能方面的应用研究逐渐增多，但经常会缺乏相应的生物标志物且过程相对比较复杂，代谢组学在动物生产中的应用受到制约。研究表明，代谢组学已被广泛用于识别标志代谢物，能够探索机体潜在的生物化学作用机制[4]。精液品质是评估种公畜种用价值的重要依据[5]。若精液品质不良会导致公畜的繁殖能力下降，甚至不育，也会给畜牧业带来一定经济损失。因此研究精液的作用机理对解决或预防上述情况、提升精液品质均具有重要意义[6]。当机体代谢发生紊乱时，机体血液营养物质含量、唾液分泌以及精液品质等也会发生相应变化，检测精液代谢物的变化情况能够发现与疾病相关的代谢产物[7]。本试验运用LC-MS检测不同精粗比日粮条件下高原型藏羊精液质量，并采用多元统计方法筛选各组中显著性代谢标志物，为研究肉羊精液品质的变化机制提供参考。1材料与方法1.1试验设计及饲养管理试验羊由青海省海北州高原现代畜牧示范园区提供。选取体况良好、体重（26.58±1.07）kg的高原型藏羊公羊15只，随机分为3组，每组5个重复，每个重复1只羊。HM组、MM组、LM组分别饲喂精粗比为70∶30、50∶50、30∶70的日粮。预试期15 d，正式试验期90 d。试验日粮参考《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）进行设计[8]，其组成及营养水平见表1。饲喂方式为单栏圈养，每天饲喂2次（7：30、18：00），试验期间公羊自由采食、饮水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.T001表1试验日粮组成及营养水平（干物质基础）项目C70组C50组C30组原料组成/%燕麦青干草30.0050.0070.00玉米42.5430.2015.90次粉2.101.500.90菜籽粕10.165.602.90棉籽粕4.903.402.10豆粕3.502.501.40食盐0.800.800.80预混料6.006.006.00合计100.00100.00100.00营养水平消化能/(MJ/kg)13.0513.0012.84粗蛋白质/%14.3712.4110.44粗灰分/%3.813.633.29粗脂肪/%7.616.765.89中性洗涤纤维/%23.8932.3040.70酸性洗涤纤维/%13.2317.7722.31注：1.预混料为每千克日粮提供：Cu 18 mg、Fe 66 mg、Zn 30 mg、Mn 48 mg、Se 0.36 mg、I 0.6 mg、Co 0.24 mg、VA 24 000 IU、VD 4 800 IU、VE 48 IU。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2测定指标及方法于正式试验期最后3 d（第88~90 d）采集各组藏羊的精液样本，进行混合摇匀后，置于-80 ℃保存。1.2.1采精量采用假阴道法采集精液，使用标有刻度的集精管测量精液量。1.2.2精子活力精液稀释液按照1∶3稀释精液，取1滴精液在洁净载玻片上，400倍电子显微镜下观察精子直线运动情况。1.2.3精子密度原精液在0.9%生理盐水中稀释后缓慢摇匀，置于苏密测定仪中检测精子质量。1.2.4精液非靶向代谢组学检测1.2.4.1精液代谢物的提取取-80 ℃保存的精液样品，解冻，使用移液枪吸取精液样本40 μL加入规格为1.5 mL EP管中标号且排序；加入120 μL甲醇，涡旋振荡30 s，沉淀蛋白，将各组样品放入离心机4 ℃、4 000 ×g离心20 min；将上清液各组取20 μL置于96孔板中，进行分析。1.2.4.2数据质量控制（QC）样本的制备待测样本取相同体积进行混合，与待测样本处理方法一致。1.2.4.3液相参数设置采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (100 mm × 2.1 mm，3.5 μm)（Agilent，USA）进行色谱分离，其中色谱柱中的柱温为30 ℃，流速为0.5 mL/min。流动相A为水，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序0~1 min，98% A~98% A；1~13 min，98% A~10% A；13~16 min，10% A~10% A；16~16.1 min，10%~98% A；16.1~20.0 min，98% A~98% A。流速为0.5 mL/min，进样体积10 μL。1.2.4.4质谱参数设置质谱条件：电喷雾电离（ESI）源，其中ESI温度120 ℃，脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂氮气流600 L/h，锥孔反吹氮气50 L/h。正离子模式毛细管电离电压为3.5 kV，离子传输管320 ℃。辅助气流速为40 psi, 10 psi, 350。取样锥孔电压（sampling cone）为 27 eV，萃取锥孔4 eV，四极杆扫描范围质荷比（m/z）50~1 500。1.3数据统计与分析试验精液样本采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析法（PLS-DA）分析，获得多变量分析PLS-DA模型重要性投影（VIP），当VIP≥1时，结合FC≥2或≤0.5且q值0.05作为差异代谢物的筛选条件，代谢通路分析基于数据库KEGG（http://www.kegg.jp/）。数据采用Excel软件进行初步统计整理，SPSS 26.0分析软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同精粗比日粮对高原型藏羊精液品质的影响（见图1）由图1可知，随着日粮中精料比例逐步增加，高原型藏羊采精量提高，精子活力以及精子密度均有不同程度提高。HM组公羊精子活力、精子密度最好，MM组公羊采精量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F001图1不同精粗比日粮对高原型藏羊精液品质的影响注：“****”表示组间差异显著（P0.05），“ns”表示组间差异不显著（P0.05）。2.2代谢物的定性与定量分析采用XCMS软件对质谱数据进行峰提取，代谢物相关的保留时间、质荷比以及离子面积等信息，连续描绘得到的总离子流图，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F002图2QC样本LC-MS总离子流图由图2可知，色谱峰基线较为平稳，峰分离效果良好，信号稳定。2.3差异代谢物单变量分析试验采用多变量分析PLS-DA模型第二主成分的VIP值（VIP≥1），结合单变量分析差异倍数（fold-change）（≥2.0或≤0.5）和q值（q值0.05）筛选差异表达的代谢物，结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F003图3差异代谢物火山图注：q值指经过多重校验的P值，q值大于或等于0.05的点标注为灰色，在0.5~2.0之间且q值≤0.05的点标注为蓝色；fold change指两组之间基因表达量的差异倍数，fold change≤0.5或≥2.0且q值≤0.05的点标注为红色。由图3可知，HM组、LM组共获得718个离子，其中上调离子278个，下调离子440个；MM组、LM组的组间共获得855个离子，其中上调离子446个，下调离子409个；HM组与MM组共获得381个离子，其中上调离子147个，下调离子234个。2.4差异代谢物多变量分析主成分分析主要用于观察各组间分离趋势以及是否有异常点出现，能够从原始数据上反映组间与组内的变异情况，主成分分析结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F004图4主成分分析结果注：PC1为主成分1；PC2为主成分2；百分比表示主成分1在此次聚类中的贡献率；图5与此同。由图4可知，HM组、MM组间第一主成分贡献率为48.65%，第二主成分贡献率26.65%，两者累计贡献率可达75.30%；MM组、LM组第一主成分贡献率为38.92%，第二主成分贡献率27.80%，两者累计贡献率可达66.72%；HM组与LM组第一主成分贡献率为50.14%，第二主成分贡献率17.38%，两者累计贡献率可达67.52%。研究表明，各组均符合主成分分析的要求。建立每两个组之间的PLS-DA模型（见图5），并对该模型参数R2和Q2进行了置换检验，次数为200次。由图5可知，模型参数R2＞0.99且Q2值＞0.99，说明当前PLS-DA模型可解释度与预测能力良好，两组间PLS-DA可用于下一步的数据分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F005图5PLS-DA模型2.5差异代谢物热图分析不同样品中代谢物的积累模式差异可以通过聚类热图进行分析，结果见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F006图6差异代谢物聚类分析注：每行为一个差异离子，每列为一个样本，不同颜色表示不同的强度，颜色从蓝色到红色，表示强度从低到高。根据图6中正、负离子模式下HM组与LM组的显著性差异代谢物层次聚类结果可知，每两组间样本中差异代谢物可明显区分。2.6各组差异代谢物的筛选及代谢途径分析KEGG富集分析分析见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.F007图7KEGG富集分析由图7可知，基于KEGG数据库进行差异代谢物功能注释，差异代谢物主要富集于嘌呤代谢（purine metabolism）、戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway）、脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis）、催乳素信号通路（prolactin signaling pathway）、氨基糖与核苷酸糖代谢（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）等通路。从最显著的前14条通路筛选出甘氨酸（glycine）、葡萄糖（glucose）、乙酰辅酶A（acetyl-CoA）、二磷酸腺苷（ADP）、α-D-半乳糖（alpha-D-galactose）作为关键性差异代谢物进行分析，结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.002.T002表2关键性差异代谢物含量鉴定组别甘氨酸葡萄糖乙酰辅A二磷酸腺苷α-D-半乳糖HM组14 096.96±955.80b27 581.10±599.78a8 075.33±733.69a6 510.09±665.80a4 360.88±487.35aMM组18 457.05±1 390.65a22 210.48±943.21b5 769.73±823.30b3 872.96±559.66b3 233.54±297.98bLM组21 264.33±2 671.76a19 261.29±510.14b4 553.07±221.73b2 072.97±179.98b2 712.48±365.45b注：同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）。μg/L由表2可知，HM组甘氨酸含量显著低于LM组和MM组（P0.05），其余葡萄糖、乙酰辅酶A、二磷酸腺苷、α-D-半乳糖4种关键性代谢物的含量均显著高于LM组和MM组（P0.05）。3讨论3.1不同精粗比日粮对高原型藏羊精液品质的影响本试验结果显示，饲喂精粗比为70∶30的日粮，公羊精子活力、精子密度最好；饲喂精粗比为50∶50的日粮，公羊采精量最高。但随着饲喂高精料日粮时间增长，公羊的精液品质下降，同时公羊体内消化代谢出现紊乱，导致生产性能下降、精液品质不理想[9]。因此，饲喂公羊精粗比为70∶30的日粮可以提高公羊精子活力以及精子密度，适合在实际生产中推广应用。3.2代谢物的定性与定量分析代谢组学是对生物体某一特定组分所包含的所有代谢物进行定性以及定量分析，并研究该代谢物动态变化与相关疾病动态变化规律的一门学科[10]。代谢产物是生化反应的最终点，可作为动物疾病发生的标志物[11]。因此，使用代谢组学分析精液代谢产物的变化，可加快精液生物标志物的筛选，还能够加强对物种的精液品质和繁殖能力的了解[12]。本文使用LC-MS技术共筛选出甘氨酸、葡萄糖、乙酰辅酶A、二磷酸腺苷及α-D-半乳糖等5种关键性差异代谢物。3.3差异代谢物单变量分析甘氨酸作为合成谷胱甘肽的重要组成部分[13]，在生物体抗氧化方面以及应激方面发挥重要作用。此外，甘氨酸还是一种有效的保护剂，可防止各种类型的有毒物质导致细胞、组织的死亡[14]。本试验结果显示，HM组藏羊精液中甘氨酸含量显著低于其他2组。原因可能是日粮精粗比下降在某种程度上导致细胞、组织损伤，从而刺激机体产生更多的甘氨酸保护剂防止细胞、组织的损伤。在无氧条件下，葡萄糖在动物能量代谢时会经过糖酵解转变成丙酮酸或乳酸（pyruvate）且有少量三磷酸腺苷（ATP）产生。精子输送管道壁的细胞成分与精液中的其他细胞成分均可能依赖精浆中的葡萄糖供能[15]。也有研究表明，表儿茶素联合低联合浓度葡萄糖复苏液能够显著提高复苏后猪冷冻精液精子的活力与质膜完整性，显著降低复苏后精子的活性氧（ROS）水平[16]。本研究中，HM组藏羊精液中葡萄糖含量显著高于其他2组，提示随着日粮精粗比的提高，精料能够为精子运动并产生位移提供更多的能源物质。3.4差异代谢物多变量分析乙酰辅酶A作为合成脂肪酸（fatty acid）、酮体（ketone bodies）等能源物质，同时也可合成胆固醇及其衍生物等生理活性物质。乙酰辅酶A是细胞内重要的代谢中间产物，能够连接糖酵解、TCA循环等代谢途径，可参与多种酶促反应[17]。本试验结果显示，MM组与LM组藏羊精液中乙酰辅酶A含量均显著低于HM组，表明日粮精粗比提高，能够为机体正常的生长发育提供更多碳源。3.5差异代谢物的筛选及代谢途径分析二磷酸腺苷（ADP）作为ATP水解产物，即断裂一个高能磷酸键，并释放能量后的产物[18]。ADP含量也能反映机体能量代谢是否正常的重要指标[19]。本试验结果显示，HM组中藏羊精液中ADP含量显著高于其他2组，可能是由于日粮中精粗比提高，增加饲料中能量水平，故释放更多的能量所致。据有关报道，分布于透明带糖蛋白上的α-D-半乳糖残基参与精-卵的相互识别和结合[20]。母猪透明带糖蛋白寡糖链上的末端半乳糖残基由大量的β-D-半乳糖残基和少量的α-D-半乳糖残基构成，主要位于透明带外层[21]。而本试验中，MM组和LM组藏羊精液中α-D-半乳糖含量均显著低于HM组，与上述研究结论具有相似之处，进一步说明了随着日粮精粗比的提高，精液中α-D-半乳糖含量明显升高，可能会促进精-卵结合。4结论本试验结果显示，日粮精粗比为70∶30时可对高原型藏羊精液品质、代谢产生明显的影响，可显著提高精子活力、精子密度以及采精量；可将甘氨酸、葡萄糖、乙酰辅酶A、二磷酸腺苷及α-D-半乳糖等作为其精液潜在生物标记物，将嘌呤代谢、戊糖磷酸途径、脂肪酸生物合成、催乳素信号通路及氨基糖与核苷酸糖代谢等作为富集通路。