牦牛是青藏高原的特有畜种之一[1]。牦牛可用于农耕，又可用于高原运输工具，为当地牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生产、生活必需品，为青藏高原经济发展作出重要贡献[2-3]。随着部分牦牛养殖方式从传统的放牧逐渐向规模化舍饲养殖模式发展[4]，探究合适日粮的精粗比对牦牛科学养殖及提高经济效益具有重要意义。饲草在瘤胃内部的代谢过程对反刍动物能量和营养的供应具有重要作用[5]。瘤胃微生物主要包括原核生物、真核生物和非细胞生命，具有密度高、多样性、相互作用的特点[6]。细菌在瘤胃中约占95%[7]，其在瘤胃中发挥主要作用。瘤胃微生物发酵与瘤胃正常活动密切相关，是保证反刍动物生理活动的基本条件[8]。目前，关于不同饲粮精粗比对反刍动物营养物质的消化利用、血清生化指标及瘤胃发酵的影响的研究较多[4-6]。研究发现，提高精粗比可以提高安格斯奶牛的干物质等营养物质的表观消化率[7]。Deusch等[8]研究发现，饲喂精粗比70∶30的饲粮，秦川肉牛的平均日增重和挥发性脂肪酸含量显著高于其他组。研究表明，瘤胃微生物的多样性和菌群结构处于动态平衡，这种平衡主要受日粮的影响[9]。Zhou等[10]研究表明，当日粮从低能量水平转换为高能量水平时，瘤胃产甲烷群落发生了变化。Li等[11]研究发现，随着饲料精粗比的改变，绵羊瘤胃菌群结构表现出明显的改变。饲喂高精料饲料时，奶牛瘤胃中产生大量乳酸和挥发性脂肪酸（VFA），导致瘤胃pH值下降[12]。饲粮精粗比的改变会导致瘤胃微生物菌群发生变化，影响牦牛生长性能和养殖效率。因此，本研究旨在利用16S rDNA高通量测序技术，研究牦牛在适应低精料转化为高精料后瘤胃细菌多样性及结构的变化，为确定精粗比转换后牦牛瘤胃微生物菌群的差异提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验在青海省海南藏族自治州贵南县老扎西养殖场进行。选择6头体重相近、体况良好的3周岁公牦牛。前2个月牦牛饲喂精粗比35∶65的日粮（C35组），后2个月牦牛饲喂精粗比为65∶35的日粮（C65组）。预试期15 d，正式试验期120 d。试验所用日粮参考《肉牛饲养标准》（NY/T 815—2004）[13]和《牦牛营养研究论文集》[14]配制，饲喂前将燕麦干草切割至4~5 cm与精料混合饲喂。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）项目C35组C65组原料组成燕麦干草65.0035.00玉米15.1929.75小麦4.238.39麸皮4.358.56菜籽粕4.328.55豆粕1.472.91棕榈油脂肪粉1.442.84磷酸氢钙1.001.00食盐1.001.00预混料2.002.00合计100.00100.00营养水平粗蛋白质11.7213.18中性洗涤纤维43.5331.36酸性洗涤纤维27.8818.36钙0.440.48磷0.430.56注：1.棕榈油脂肪粉能量为27.42 MJ/kg，数值参考NRC（2106）[15]。2.预混料为每千克日粮提供：VA 500 IU、VE 40 IU、Fe 65 mg、Cu 10 mg、Zn 25 mg、Mn 30 mg、I 0.5 mg、Co 0.1 mg。3.营养水平均为实测值。%1.2饲养管理牦牛在试验期间每天8：00、17：00进行饲喂，保持相同的饲喂环境，保证自由饮水。预试期保证牦牛第2 d饲喂前有剩余料草。正式试验期每隔30 d，将饲料样本分为4份后混合均匀进行取样，将样本放入65 ℃烘干箱烘干至常温，粉碎，装入自封袋，-50 ℃冰箱保存。在正式试验期第90 d，采集瘤胃液前1 d晚上禁止投喂饲料，第2 d早上，采用胃管式采样器抽取每头牦牛150 mL瘤胃液，利用4层纱布过滤，测定pH值，剩余的瘤胃液装至15 mL离心管中临时保存。1.3测定指标及方法1.3.1瘤胃微生物菌群测定利用16S rRNA技术测定瘤胃微生物菌群多样性。瘤胃液样品送至北京奥维森基因科技有限公司测序，测序平台为MiseqPE300。1.3.2样品DNA提取从样品中抽取基因组DNA，完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。1.3.3PCR扩增按指定测序区域合成带有barcode的特异引物或合成带有错位碱基的融合引物。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带，并用Agencourt AMPure XP 核酸纯化试剂盒纯化。1.3.4测序DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥（bridge）”。PCR扩增，产生DNA簇。DNA扩增子线性化成为单链，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端黏性，继续聚合第二个核苷酸。统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。1.3.5序列分析原始数据下机后，结果以Fastq格式存储。利用Trimmomatic（v0.36）、Pear（v0.9.6）、对Fastq数据进行处理和质量过滤。利用Pear（v0.9.6）、Flash（v1.20）、根据PE的overlap关系对两端序列进行拼接（merge）处理，最小overlap设置10 bp，错配率为0.1，得到Fasta序列3，根据已知数据库用uchime方法比对去除Fasta序列的嵌合体，对于未知数据库使用自比对（denovo）方法进行去除，得到有效序列。根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，对相似性大于97%的序列产生操作分类单元（OTU），对OTU聚类、物种分类学、多样性指数、群落结构进行统计分析。通过PICRUSt对16S高通量测序数据进行代谢途径的功能预测。1.4数据统计与分析试验数据通过Excel处理，利用SPSS 26.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误（SEM）表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群丰度与多样性的影响2.1.1精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群α多样性的影响（见表2）由表2可知，C35组牦牛瘤胃微生物谱系多样性（PD whole tree）值、牦牛瘤胃微生物丰度Chao1指数均显著高于C65组（P0.05），表明牦牛日粮精粗比后期转换为65∶35降低了牦牛瘤胃微生物菌群的多样性和丰度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.T002表2精日粮粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群α多样性的影响项目Chao1指数Shannon指数Simpson指数PD whole treeC35组1 292.37a7.100.9786.75aC65组1 172.02b6.600.9679.44bSEM28.410.150.011.67P值0.030.110.640.02注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著。2.1.2日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群beta多样性的影响牦牛瘤胃微生物PCoA分析见图1。由图1可知，在第1主成分（PC1）贡献率为29.13%时，C35组和C65组间及组内的距离都较分散，表明组内及组间的细菌多样性差异明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.F001图1牦牛瘤胃微生物PCoA分析2.2日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群OTU分布的影响牦牛瘤胃微生物Venn分析见图2。由图2可知，C35组牦牛瘤胃微生物总的OTUs数为1 783个，C65组牦牛瘤胃微生物总的OTUs数为1 804个。C35组和C65组牦牛瘤胃微生物共有OTUs数为1 433个。C35组特有OTUs数为350个，C65组特有OTUs数为271个，表明C35组特有的OTUs数高于C65组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.F002图2牦牛瘤胃微生物Venn分析2.3日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群组成的影响2.3.1牦牛瘤胃微生物菌群门水平分析（见表3）精粗比转换饲喂后，牦牛瘤胃中共鉴定出19种菌门。由表3可知，在门水平上，牦牛瘤胃中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度较高。C35组牦牛瘤胃微生物中脱硫菌门丰度极显著高于C65组（P0.01），C35组牦牛瘤胃微生物中疣微生物门显著高于C65组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.T003表3牦牛瘤胃微生物菌群门水平分析项目C35组C65组SEMP值厚壁菌门0.6540.5490.050.28拟杆菌门0.2660.3880.050.24放线菌门0.0470.0370.010.54髌细菌门0.0180.0150.010.50脱硫菌门0.003A0.001B0.010.01螺旋体门0.0020.0020.010.80变形杆菌门0.0010.0020.010.08疣微菌门0.002a0.001b0.010.02纤维杆菌门0.0020.0010.010.86蓝藻门0.0010.0010.010.65注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3.2牦牛瘤胃微生物菌群属水平分析（见表4）日粮精粗比转换饲喂后，牦牛瘤胃中共涉及182个菌属。由表4可知，C35组牦牛瘤胃微生物中UCG-005和未培养属的丰度极显著高于C65组（P0.01）；C65组牦牛瘤胃微生物中普氏菌科UCG-003属的丰度显著高于C35组（P0.05）；C35组牦牛瘤胃微生物中未培养细菌属的丰度显著高于C65组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.T004表4牦牛瘤胃微生物菌群属水平分析项目C35组C65组SEMP值丁酸弧酸属0.0330.0340.0050.95糖链假丝酵母属0.0180.0150.0020.56克里斯滕森菌科R-7属0.0780.0710.0090.71漆树科 NK3A20 组0.0590.0600.0080.10NK4A214 组0.0560.0510.0070.71奥尔塞内拉属0.0330.0240.0060.52普雷沃菌属0.1210.2500.0490.20普氏菌科UCG-001属0.0040.0090.0030.40普氏菌科UCG-003属0.004b0.012a0.0020.02奎氏菌属0.0280.0860.0240.25里肯内拉科属RC9肠组0.0630.0470.0050.13瘤胃球菌属0.0590.0670.0100.68高氏瘤胃球菌属0.0080.0060.0010.10琥珀属0.0130.0270.060.24UCG-0050.015A0.003B0.0020.01未培养的属0.032A0.014B0.0030.01未培养细菌属0.075a0.045b0.0070.03未培养瘤胃细菌属0.0880.0680.0080.20未识别属0.0400.0260.0050.22维勒内尔科属UCG-0010.0140.0100.0020.442.4牦牛日粮精粗比转换LEfSe分析（见图3）将LDA阈值设定为3，利用LEfSe比较两组菌群差异性。由图3可知，在各类水平上C35和C65有18种差异物种，17种在C35组显著富集，1种在C65组显著富集。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.F003图3牦牛日粮精粗比转换LEfSe分析注：f_F082为F082科，f_Desulfovibrionaceae为脱硫菌科，o_Desulfovibrionales为脱硫菌目，c_Desulfovibrionia为脱硫弧菌纲，f_Streptococcaceae为链球菌科，o_Lactobacillales为乳酸菌目；f_Saccharofermentans为糖发酵菌科，o_Hungateiclostridiaceae为杭白菊目；f_Lachnospiraceae为拉赫诺斯拉科属；f_Eubacterium_coprostanoligenes_group为真杆菌前列烷醇生成组科；f_UCG_010；f_UCG_011为f__UCG_011：UCG_011科；o_Oscillospirales为示波螺旋目，f_Peptococcaceae为消化球菌科，o_Peptococcales为肽球菌目，f_Anaerovoracaceae为厌氧菌科，o_Peptostreptococcales_Tissierellales为消化链球菌目，c_Clostridia为梭菌属纲。2.5日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群代谢途径的影响（见表5）碳水化合物代谢是最丰富的代谢途径，其次是氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、萜类化合物和聚酮酸的代谢、其他氨基酸的代谢、复制和修复、能量代谢、脂代谢、聚糖生物合成和代谢。由表5可知，C35组信号分子和相互作用、耐药性：抗菌的基因家族显著高于C65组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.002.T005表5日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群代谢途径的影响项目C35组C65组SEMP值氨基酸代谢13.1313.100.050.41辅因子和维生素的代谢12.6312.200.210.20碳水化合物代谢13.9014.100.050.16异生素生物降解和代谢2.312.100.200.64运输和分解代谢0.200.210.010.50译本3.603.500.020.32转录1.211.200.020.20信号分子和相互作用4.62×10-5a7.03×10-6b3.45×10-50.04信号转导0.400.320.020.36复制和修复6.316.300.030.90核苷酸代谢2.102.100.020.52萜类化合物和聚酮酸的代谢10.4010.100.020.50其他氨基酸的代谢7.127.010.080.50膜运输1.701.700.050.82脂类代谢5.005.000.140.12传染病：细菌性0.20a0.20b0.010.04免疫系统0.100.100.010.60聚糖生物合成和代谢3.744.600.230.12折叠、分类和降解3.303.100.030.07排泄系统4.75×10-75.49×10-79.56×10-71.00环境适应0.240.230.011.00能量代谢5.605.700.050.34内分泌系统0.100.100.010.32耐药性：抗菌0.20a0.12b0.010.04消化系统0.040.100.010.21细胞群落—原核生物0.200.200.011.00细胞运动2.903.000.231.00细胞生长和死亡2.002.000.200.16其他次级代谢物的生物合成2.162.300.070.403讨论3.1日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群丰度与多样性的影响16S rDNA高通量测量技术主要应用在鉴定和分类微生物、估计样本中微生物菌群的多样性[16]。Shannon值、PD whole tree值、Chao1值等是评价微生物菌群多样性的指标。Benchaar等[17]研究发现，随着饲料中精料水平的增加，奶牛瘤胃中微生物菌群多样性和丰度显著降低。徐晓锋等[18]研究发现，低精料组奶牛瘤胃中微生物菌群的丰度和多样性均显著高于高精料组。本试验中，将饲料转换为高精料，牦牛瘤胃微生物菌群的丰度和多样性均显著降低，表明不同精粗比饲料会影响牦牛瘤胃微生物菌群，随着精料的增加会降低瘤胃微生物菌群的丰度和多样性。3.2日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群丰度与多样性的影响饲料组成是影响牦牛瘤胃微生物组成和数目主要因素之一[19]。研究表明，厚壁菌门、拟杆菌门是反刍动物瘤胃的优势菌门[20-21]。拟杆菌门在反刍动物的瘤胃中具有降解碳水化合物的作用[20]，厚壁菌门在反刍动物的瘤胃中具有降解纤维物质的作用[22]。De Oliveira等[23]研究不同精粗比对反刍动物瘤胃微生物菌群多样性的影响，发现厚壁菌门和拟杆菌门占整个菌门的比例较大。本试验表明，C35组和C65组牦牛瘤胃菌群的厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度最高，但本次研究C35组和C65组之间厚壁菌门和拟杆菌门的差异均不显著，表明饲喂后期转化为精粗比65:35饲料，对牦牛瘤胃微生物菌群厚壁菌门和拟杆菌门的丰度影响并不明显。脱硫菌门是瘤胃中主要的硫酸盐还原细菌（SRB）之一，SRB与肠道疾病有关，利用质子产生硫化氢，较高的硫含量可能引起瘤胃上皮的炎症反应[24-25]。本试验发现，C65组牦牛瘤胃菌群中脱硫菌门丰度极显著低于C35组，表明由低精料转变为高精料饲料可以有效地降低脱硫菌门的丰度，减少疾病。普雷沃氏菌是反刍动物瘤胃中数量最多的菌属之一[26]，具有降解高度活性半纤维的能力，可以利用淀粉、其他非纤维素多糖和单糖作为能量来源，由此产生的丙酸盐通过糖异生在维持宿主动物的葡萄糖稳态中起关键作用[27]。庞凯悦等[28]研究发现，在不同饲养方式下普雷沃氏菌是牦牛瘤胃微生物菌群中的优势菌属。霍俊宏等[29]研究发现，在努比亚山羊瘤胃菌群中普雷沃氏菌是优势菌属。本试验发现，C35组和C65组牦牛瘤胃普雷沃氏菌属的相对丰度均最高，C65组牦牛瘤胃的普雷沃氏菌属相对丰度高于C35组，但差异不显著，表明提高精料占比可以有效提高普雷沃氏菌属的数量，达到提高降解半纤维能力的效果。普氏菌科UCG-003属属于普雷沃氏菌属。研究表明，普氏菌科UCG-003属参与葡萄糖代谢，产生乙酸和琥珀酸作为最终发酵产物，可以提高饲料利用率[30-31]。Dai等[32]研究发现，提高牦牛饲料中精料含量能够提高牦牛瘤胃中国普氏菌科UCG-003属的相对丰度。Chen等[30]研究发现，与其他组相比高精料组安格斯牛瘤胃中普氏菌科UCG-003属相对丰度最高。本试验发现，C65组的普氏菌科UCG-003属相对丰度显著高于C35组，表明后期转化为高精料，有助于牦牛葡萄糖代谢上调，提高饲料利用率。3.3日粮精粗比转换对牦牛瘤胃微生物菌群代谢途径的影响KEGG包含基因组、代谢、信号通路等多种信息[33]。碳水化合物代谢是最丰富的代谢途径以及优异的能量来源，在反刍动物体内可以用于分解代谢、获得能量（ATP）或参与合成代谢[34]。本试验发现，C35组和C65组牦牛瘤胃碳水化合物代谢相对丰度均最高，C65组的相对丰度略高于C35组，表明增加精料比有助于碳水化合物代谢上调。C35组信号分子和相互作用、耐药性：抗菌的基因家族均显著高于C65组，表明随着后期转换为高精料饲料，可以有效减少疾病并有助于牦牛葡萄糖代谢上调，提高饲料利用率。4结论本试验表明，日粮精粗比由35∶65转换为65∶35影响了牦牛瘤胃微生物菌群，随着精料比例的增加会降低瘤胃微生物菌群的丰度和多样性，降低牦牛瘤胃脱硫菌门的丰度，减少疾病代谢通路，上调葡萄糖代谢通路，因此适当提高牦牛日粮精粗饲料比例可以提高饲料利用率。