肠上皮细胞（IEC）具有吸收营养、提供屏障等功能[1]。肠道损伤与肠上皮细胞凋亡的增加有关，其过度凋亡会破坏肠道屏障完整性，造成肠道损伤及慢性炎症疾病，从而影响畜禽的生产性能[2]。大多数诱导外源性受体驱动的IEC凋亡的通路成分，包括启动子和效应子caspases等，线粒体也会驱动IEC凋亡，如Bcl-xl、Bcl-2和细胞色素c等。凋亡是机体正常肠道上皮细胞脱落的主要原因，在回肠黏膜上皮细胞的更新过程中发挥着重要作用。蛋氨酸（Met）作为牛、山羊等反刍动物的第一限制性氨基酸[3]，能够改善动物肠道黏膜完整性和健康，对生长羔羊的肠道黏膜完整性和菌群组成具有积极影响[4]。Song等[5]研究表明，Met作为有机氮源，缺乏Met会导致凋亡细胞数量增加，而NH4Cl作为无机氮以浓度依赖的方式降低细胞活力，抑制PI3K/Akt通路和mTOR通路蛋白表达，引起细胞凋亡[6]。研究表明，Met和NH4Cl的缺失或不足均能够以不同机制导致细胞凋亡，危害动物肠道健康，并降低动物生产性能[5-6]。因此，研究氮源对细胞凋亡的影响具有重要意义。目前对细胞凋亡的研究已较为深入，但以正常细胞为试验材料、营养干预方法研究反刍动物肠道细胞凋亡的报道仍然较少。本试验以正常山羊回肠上皮细胞为试验材料，探究Met和NH4Cl作为不同氮源对其细胞凋亡的影响及作用机制，研究反刍动物回肠黏膜脱落的上皮细胞凋亡及其通路作用机制，对于揭示有机氮和无机氮在反刍动物中的作用差异，为生产中采用无机氮替代有机氮提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1细胞来源试验采集屠宰后的6头湘东黑山羊的回肠中段，分离原代上皮细胞作为细胞来源。1.1.2氮源蛋氨酸（L-Met，CAS No m-9625，99.5%）、氯化铵（NH4Cl，CAS NO.12125-02-9，99.99%）均购自Sigma公司。1.1.3主要试剂Bax、PI3K、p-AKT(Ser473)、p-mTOR(Ser2481)、p-AMPK、β-Actin购自Cell Signaling Technology公司，Antibody against Bcl-2、Rabbit monoclonal Antibody against β-Actin购自Signaling Antibody Biotechnology公司，Western blot所用二抗均购自中杉剑桥，Hochest33342发光检测试剂盒和AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，JC-1染色检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，逆转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，Met缺失DMEMF/12和DMEM高糖培养基购自武汉博士德生物工程有限公司，DEPC、EB试剂购自北京赛百盛基因技术有限公司，TRIZOL购自美国Invitrogen公司，Taq酶、DL2000 DNA Marker、dNTP购自MBI Fermntas公司，引物购自上海生工基因技术有限公司，SYBGREEN PCR Mix购自TAKARA公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara, Dalian, China）。常规化学试剂购自北京化学试剂公司。1.2试验方法1.2.1细胞增殖试验选取Met和NH4Cl作为2种不同的氮源，采用CCK-8试剂盒对山羊回肠上皮细胞进行细胞增殖试验，根据预试验，选取上皮细胞培养基中0.2 mmol/L Met为对照组。将山羊回肠上皮细胞培养至密度达到60%左右时，分为5组，各组分别添加0、0.08、0.20 mmol/L Met（对照组）以及0.08、0.20 mmol/L NH4Cl。5组分别设定0、12、24、36、72 h的处理时间，每个设置12个重复。培养至设定时间点时，更换为100 μL DMEM/F12或者DMEM培养液（含10%CCK-8试剂），培养箱中孵育2 h，置于酶标仪（Bio-Tek, Winooski, VT，USA），在450 nm波长下测定各处理组的OD值。根据细胞增殖试验结果，筛选出最适的氮添加浓度，采用筛选出的2种氮源中最适浓度进行后续试验。1.2.2Hochest33342染色荧光显微镜检测细胞凋亡将处于对数生长期的回肠上皮细胞分别接种于6孔板中，待细胞浓度达到60%时，将筛选出的0、0.2 mmol/L Met（对照组）和0.2 mmol/L NH4Cl分别添加至6孔板中，共3个处理，每个处理设3个重复，培养24 h，弃上清，PBS冲洗3遍，每孔添加1 mL Hochest33342染液置于培养箱内避光温育30 min。分别取出6孔板于倒置荧光显微镜下，波长365 nm的紫外光下观察细胞生长及凋亡情况，并拍照记录。1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡将山羊回肠上皮细胞接种于6孔板中，培养至细胞浓度达到60%时，各组分别添加0、0.2 mmol/L Met（对照组）和0.2 mmol/L NH4Cl，每个处理设置3个重复，培养24 h，弃上清，PBS冲洗3遍，每孔添加0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶进行消化，含血清的培养基终止消化。其后收集细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，PBS重复洗涤2次，加入5 μL AnnexinV-FITC 混匀后，再加入5 μL PI混匀。室温避光反应5~15 min，置于流式细胞仪观察和检测细胞凋亡状况。1.2.4线粒体膜电位的检测采用胰酶对处理好的细胞进行消化后置于1.5 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，PBS洗涤1次，离心后弃上清，1 mL培养基重悬，加入JC-1母液，使其终浓度为10 mg/L，混匀，置于细胞培养箱中37 ℃避光孵育20 min。孵育结束，4 ℃、1 500 r/min离心3~4 min，使细胞沉淀，PBS洗涤2次，再用适量PBS重悬，进行流式检测。1.2.5凋亡关键蛋白及信号通路蛋白表达的影响1.2.5.1样品制备使用已预冷的PBS洗涤细胞1次，3 000 r/min离心2 min，弃上清，加入100 μL RIPA裂解液，反复吹打混匀后置于冰上，蛋白裂解反应10 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清分装至0.5 mL离心管中。1.2.5.2蛋白表达检测完全溶解并稀释蛋白标准品至浓度为2 g/L，将标准品和样品添加至96孔板并稀释至总体积20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃静置30 min，采用酶标仪测定A562 nm，根据标准曲线计算出样品蛋白浓度。1.2.5.3WB试验分别配制12.0％分离胶和4.8％浓缩胶，上样使总蛋白达50~100 μg，加入5×loading buffer混匀后沸水煮5 min，放入冰盒速冷。根据定量结果，点入marker，其余孔上样20 μL已变性蛋白，分别在分离胶和浓缩胶下电泳。1.2.5.4转膜6个样品切胶在300 mA转膜，caspase3约55 min，BCL-2、BAX、LC3B约45 min，beclin1约80 min，β-actin约60 min。转膜完毕后，取出放入1×TBST中洗涤5 min。采用丽春红染液染膜并检测蛋白转膜的效率，再用1×TBST洗净丽春红，将膜浸入5%脱脂奶粉，室温放置1.5 h进行封闭。先后将膜与稀释后的一抗及HRP标记的二抗孵育，其后用ECL显影冲洗，一抗来源信息及稀释比例见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.T001表1一抗来源信息及稀释比例项目第一抗体货号第一抗体来源稀释比例抗体公司半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase3）9665sRabbit1∶1 000美国CSTB淋巴细胞瘤-2（BCL-2）ab59348Rabbit1∶1 000英国abcamBCL2-Associated X的蛋白质（BAX）50599-2-APRabbit1∶2 000美国proteintechP53抑癌基因（P53）10442-1-APRabbit1∶1 200美国proteintechB细胞淋巴瘤因子2 XL（BCL-XL）10783-1-APRabbit1∶1 200美国proteintech磷酸肌醇3激酶（PI3K）42635Rabbit1∶500美国proteintech磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）4060SRabbit1∶1 000美国proteintech磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）2974SRabbit1∶1 000美国proteintech磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）8208SRabbit1∶1 000美国proteintech磷酸化β-肌动蛋白（β-actin）60008-1-IgMouse1∶5 000美国proteintech1.3数据统计与分析将各项试验数据上传至SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析，Turkey-Kramer进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同氮源和浓度对山羊回肠上皮细胞增殖的影响（见表2）由表2可知，处理24 h，Met缺失组和0.20 mmol/L NH4Cl组山羊回肠上皮细胞的OD值显著低于0.08 mmol/L Met组、0.20 mmol/L Met组和0.08 mmol/L NH4Cl组（P0.05），Met缺失组山羊回肠上皮细胞活性显著低于0.20 mmol/L NH4Cl组（P0.05）。因此，筛选不添加Met、0.20 mmol/L Met（对照组）和0.20 mmol/L NH4Cl进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.T002表2不同来源和浓度的氮源对山羊回肠上皮细胞增殖的影响组别12 h24 h36 hMet缺失组0.621±0.005c0.574±0.016d0.328±0.011c0.08 mmol/L Met组0.646±0.015b0.679±0.041b0.517±0.009b0.20 mmol/L Met（对照组）0.673±0.013a1.122±0.007a1.408±0.030a0.08 mmol/L NH4Cl组0.639±0.017bc0.675±0.035b0.507±0.007b0.20 mmol/L NH4Cl组0.618±0.004c0.619±0.003c0.325±0.014c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），下表同。2.2不同处理组对山羊回肠上皮细胞凋亡形态的影响（见图1）经Hochest33342染色后，呈现出均匀蓝色的细胞为正常细胞，而核皱缩呈致密浓染的为凋亡细胞。由图1可知，在荧光显微镜下，Met缺失组、0.20 mmol/L Met组（对照组）和0.20 mmol/L NH4Cl组处理24 h后山羊回肠上皮细胞，呈现出典型凋亡细胞的形态，即细胞的体积缩小、核固缩，细胞核或细胞架内可观察到致密的蓝色颗粒状强荧光。对照组细胞则观察到弥散性均匀荧光，荧光较弱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.F001图1不同处理对回肠上皮细胞凋亡形态的影响（200×）2.3不同处理对山羊回肠上皮细胞凋亡率的影响（见图2、表3）由图2、表3可知，Met缺失组山羊回肠上皮细胞的总凋亡率、早期细胞凋亡率（LR）和晚期凋亡率（UR）均最高，显著高于0.20 mmol/L Met组和0.20 mmol/L NH4Cl组（P0.05）。0.20 mmol/L NH4Cl组山羊回肠上皮细胞的LR显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.F002图2不同处理对山羊回肠上皮凋亡率的影响（a） 0.20 mmol/L Met组 （b） 0.20 mmol/L NH4Cl组 （c） Met缺失组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.T003表3不同处理组山羊回肠上皮细胞凋亡率的变化（n=3）组别URLRUR+LRMet缺失组9.58±1.02a4.01±0.85a13.59±1.92a0.20 mmol/L Met组4.67±0.66c1.91±0.22c6.58±0.83c0.20 mmol/L NH4Cl组7.51±1.12b3.36±0.44b10.87±1.45b%2.4不同处理对细胞线粒体膜电位和细胞凋亡关键蛋白的影响（见图3、表4、图4、表5）由图3、表4可知，与对照组对比，0.20 mmol/L NH4Cl组和Met缺失组的线粒体膜电势分别显著下降到81.99%和77.67%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.F003图3不同处理对细胞线粒体膜电位的影响（a） 0.20 mmol/L Met组 （b） 0.20 mmol/L NH4Cl组 （c） Met缺失组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.T004表4不同处理组对细胞线粒体膜电位的影响（n=3）组别膜电位0.20 mmol/L Met组90.88±2.70a0.20 mmol/L NH4Cl组81.99±1.20bMet缺失组77.67±1.60c%由图4、表5可知，与对照组相比，Met缺失组和0.20 mmol/L NH4Cl组中回肠上皮细胞促凋亡蛋白Caspase-3、Bax和P53的表达均显著上调（P0.05），而抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达均显著下调（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.F004图4不同处理细胞凋亡关键蛋白的变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.T005表5不同处理组细胞凋亡关键蛋白的变化（n=3）组别Caspase-3Bcl-2BaxP53Bcl-xlMet缺失组0.34±0.04a0.14±0.02c0.33±0.02a0.38±0.03a0.12±0.01c0.20 mmol/L Met组0.19±0.07c0.26±0.05a0.11±0.01c0.11±0.04c0.31±0.01a0.20 mmol/L NH4Cl组0.28±0.03b0.19±0.02b0.22±0.01b0.23±0.05b0.21±0.04b%2.5PI3K-AKT-mTOR和AMPK-mTOR信号通路关键蛋白的表达（见图5、表6）由图5、表6可知，与对照组相比，Met缺失组和0.20 mmol/L NH4Cl组细胞的p-AMPK蛋白的表达均显著上调（P0.05），而p-mTOR、PI3K和p-AKT的蛋白表达量显著下调（P0.05）。研究表明，Met缺失组和0.20 mmol/L NH4Cl组均通过PI3K-Akt-mTOR和AMPK-mTOR信号通路诱导回肠上皮细胞凋亡，而NH4Cl对细胞凋亡具有一定程度上的缓解作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.F005图5不同处理组细胞PI3K-Akt-mTOR和AMPK-mTOR信号通路关键蛋白的变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.011.T006表6不同处理细胞PI3K-Akt-mTOR和AMPK-mTOR信号通路关键蛋白的变化（n=3）组别p-mTORp-AMPKPI3Kp-AktMet缺失组0.38±0.02c0.78±0.08a0.32±0.06c0.38±0.07c0.20 mmol/L Met组0.59±0.06a0.45±0.04c0.61±0.03a0.58±0.05a0.20 mmol/L NH4Cl组0.45±0.03b0.68±0.08b0.47±0.04b0.45±0.06b%3讨论3.1不同氮源及浓度对山羊回肠上皮细胞增殖的影响Met对各种动物的肠道发育起重要作用。缺乏Met对肠道健康[7]及肝脏β氧化存在至关重要的作用，而β氧化的受损会引起氧化应激[8]，进而导致细胞凋亡[9]，从而影响细胞增殖。NH4Cl作为无机氮源的一种，应用于饲料添加剂替代有机氮源可在一定程度上缓解氧化应激引起的细胞凋亡，降低细胞活性的损失，对反刍动物肠道健康具有重要意义。本试验中，不同处理时间0.08 mmol/L Met组及NH4Cl组间回肠上皮细胞活性差异不显著，而24 h时，不添加Met组回肠上皮细胞活性显著低于0.20 mmol/L NH4Cl组，因此选取不添加Met及0.20 mmol/L NH4Cl进行后续试验。3.2不同处理对凋亡细胞形态的影响发生凋亡后的细胞与正常细胞相比，形态学上发生体积缩小变圆[10]，核固缩、核碎裂和产生凋亡小体[11]。本试验中，细胞体积缩小、核固缩，细胞核或细胞架内可观察到致密的蓝色颗粒状强荧光，与上述内容一致。产生这种形态变化的原因可能是Met缺失和添加NH4Cl后的凋亡细胞中BCL-2蛋白质家族[12]和caspase家族蛋白[13]表达发生变化。3.3不同处理对细胞凋亡率的影响Cunningham等[14]报道，Met缺失会导致细胞周期停滞，细胞凋亡增加。本试验中，进行Met缺失处理后，不添加Met组回肠上皮细胞的总凋亡率、早期细胞凋亡率（LR）和晚期凋亡率（UR）均最高，显著高于0.20 mmol/L Met组和0.20 mmol/L NH4Cl组。原因可能是Met的缺失引起细胞代谢氧化产生应激反应[8]，从而出现Met缺失组凋亡率上升的现象。另有报道，NH4Cl作为无机氮是反刍动物胃肠道微生物细胞生长和淀粉促进消化的氮源[15]，充足的氮营养可以抑制细胞凋亡[16]。结合本试验NH4Cl添加组细胞总凋亡率显著低于Met缺失组，可以推测以NH4Cl代替Met可以缓解细胞凋亡。因此，将NH4Cl应用于反刍动物作为无机氮源对研究反刍动物肠道生理及健康具有重要意义。3.4不同处理对线粒体膜电位及凋亡关键蛋白表达的影响细胞凋亡作为一种程序性细胞死亡途径，可以被产生促凋亡和抑凋亡信号的特定蛋白调控。本试验发现，Met缺失和添加NH4Cl处理后线粒体膜电位与对照组相比显著下降，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax和P53的表达显著上调，而抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达均有显著下调，与Gao等[13]的研究中Bax、Bad、caspase-3表达升高，Bax蛋白表达升高，线粒体膜电位降低，Bcl-2蛋白表达降低具有相同的表达趋势。同时Bax/Bcl-2的比值变大，表明Met缺失和NH4Cl添加促进Bax/Bcl-2比值的升高，从而诱导回肠上皮细胞凋亡，与Zhou等[11]的研究发现凋亡细胞的Bax/Bcl-2比值升高，Caspase-3活化增强一致。原因可能是Bax和P53等蛋白线粒体膜结合导致线粒体膜通透性增加[17]，膜电位丢失从而使细胞色素C释放，其释放作用会引起Caspase蛋白家族的激活[11]，从而Caspase-3引起表达上升基因通过外在途径引起细胞凋亡，使本试验结果呈现凋亡率显著上升。3.5不同处理对信号通路关键蛋白的影响PI3K/AKT/mTOR信号通路在信号转导和细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成等生物过程的调控中发挥重要作用[18]。本试验中，Met的缺失和添加NH4Cl均使p-mTOR、PI3K和p-AKT的表达下调。Luo等[19]发现，Akt/AMPK/mTOR信号通路引发自噬会降低细胞凋亡率；Liao等[20]发现，抑制磷酸化激活的PI3K和AKT使细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达均显著提升，均与本试验结果相近。原因是不同氮源的刺激使PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制，从而引起细胞凋亡。但在本试验中AMPK的表达情况呈现相反的趋势，可能是由于氮源的刺激通过激活AMPK信号通路对细胞凋亡起调节作用[21]，因此推测Met缺失和NH4Cl替代诱导的凋亡的发生可能是通过PI3K-AKT-mTOR和AMPK-mTOR信号通路来完成。4结论本研究表明，Met缺失组和0.20 mmol/L NH4Cl组均通过PI3K-Akt-mTOR和AMPK-mTOR信号通路诱导回肠上皮细胞凋亡，而NH4Cl对细胞凋亡具有一定程度上的缓解作用，对研究反刍动物肠道健康具有重要意义。