猴头菇（Hericium erinaceus）是一种珍贵的食药兼用真菌，其营养价值丰富，具有较高的药用价值[1-2]。猴头菇生产加工过程中会产生大量的废弃菌渣，而猴头菇菌渣中仍含有丰富的营养物质，如猴头菇菌渣多糖等[3]。猴头菇多糖是猴头菇中的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性[4-5]。近年来，研究和开发具有生物活性的天然饲料添加剂受到关注[6]。而猴头菇多糖因具有良好的生物活性，能够提高动物的生长性能、免疫力和抗氧化能力，可作为一种高效、安全的天然添加剂用于动物生产[7-10]。陶守均等[11]研究表明，饮水中添加猴头菇多糖能够显著降低猪的腹泻率、料重比。目前猴头菇多糖的提取物工艺研究已较为广泛[12]，主要的提取方法包括热水浸提法[13]、酶解提取法[14]、超声波提取法[15]和微波超声波组合提取法[16]等。但大研究多集中于对猴头菇或其菌丝[17-18]，关于猴头菇菌渣中多糖的提取及其工艺优化的研究相对较少[19]。本研究采用超声波法提取猴头菇菌渣多糖，单因素试验和正交试验优化猴头菇菌渣多糖提取工艺参数，进一步研究其体外抗氧化性能，以期为猴头菇菌渣在动物生产的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器猴头菇菌渣购自华秣（山东）生物科技有限公司，干物质含量为93.43%，粗蛋白质含量为9.55%，粗纤维含量为30.43%，粗脂肪含量为2.04%，灰分含量为12.73%，钙含量为0.52%，磷含量为0.73%。维生素C购自扶风斯诺特生物科技有限公司。石油醚、无水乙醚、苯酚、浓硫酸、氯仿和无水乙醇等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。30-B粉碎机（南京华莎干燥设备有限公司），TD-5B高速冷冻离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司），R-1005大型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司），AYLH-6930真空干燥箱（中研立华仪器科技(苏州)有限公司），HD-UV90紫外分光光度计（山东霍尔德电子科技有限公司）等。1.2试验方法1.2.1猴头菇菌渣样品预处理将猴头菇菌渣置于60 ℃的恒温烘箱中烘干8 h，粉碎，过60目筛，得到猴头菇菌渣干粉，将猴头菇菌渣干粉样品置于索氏抽提装置中，使用石油醚作为提取液，对菌渣干粉进行脱脂处理，在30~60 ℃下回流脱脂3次后，使用85%的乙醇提取去除单糖和低聚糖，过滤，105 ℃烘干，分装并置于-20 ℃冰箱保存。1.2.2猴头菇菌渣多糖提取工艺称取5.000 g猴头菇菌渣干粉，以液料比15 mL/g向样品中加入蒸馏水调浆混匀。在室温下（26 ℃），利用超声波以300 W功率对调浆后的样品处理15 min，静置10 min，再次进行超声波处理，重复3次。将处理后的样品在10 000 r/min离心10 min，转移上清液至旋转蒸发仪中，浓缩至原溶液体积50%，加入3~4倍样品体积的无水乙醇混匀，置于4 ℃的冰箱中醇沉，24 h后取出后进行抽滤，将得到的沉淀用无水乙醇、氯仿和无水乙醚进行反复洗涤3次，经过冷冻干燥，得到粗多糖。采用苯酚-硫酸法[20]测定猴头菇菌渣中多糖含量，以葡萄糖标准品为对照。根据测得的吸光度及对应的葡萄糖溶液浓度制作标准曲线，得回归方程为y=0.017 3x+0.018 2，R2=0.997 1。取猴头菇菌渣多糖样品，使用蒸馏水溶解，制成待测样品溶液，按照苯酚-硫酸法测得的吸光度，带入标准曲线，计算样品中的多糖含量。多糖得率=多糖含量菌渣质量×100% （1）1.2.3提取工艺单因素试验设计以1.2.2中猴头菇菌渣多糖提取工艺为基础条件，采用单因素轮换法，依次改变液料比（5、10、15、20、25、30 mL/g）、超声波功率（100、150、200、250、300、350 W）、超声时间（5、10、15、20、25、30 min）、超声次数（1、2、3、4、5、6次）。各影响因素各水平分别进行独立提取试验，且每个试验分别设置3个平行样，结果取3次试验的平均值。1.2.4正交试验设计基于单因素试验结果，设计4因素4水平L16(44)正交试验[21]。各正交试验均进行2次平行重复试验。正交试验因素水平设计见表1。以液料比、超声波功率、超声时间和超声次数研究对象，多糖提取率为考察指标，探究并确定猴头菇菌渣多糖的最佳提取工艺参数组合，并进行验证试验，证实该工艺参数组合的可靠性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T001表1正交试验因素水平设计水平A液料比/(mL/g)B超声波功率/WC超声时间/minD超声次数/次1152001022202501533253002044303502551.2.5最优工艺组合下猴头菇菌渣多糖提取率及体外抗氧化活性利用上述最优生产工艺组合提取猴头菇菌渣中多糖，试验设6次重复，取平均值。之后对获得的猴头菇菌渣多糖其各抗氧化活性进行检测，指标包括DPPH自由基清除率[22]、超氧阴离子自由基清除率[23]和ABTS+自由基清除率[24]。各抗氧化活性指标均以维生素C（VC）为参照。各检测指标的结果取3次连续测定的平均值。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2013软件进行记录和整合，SPSS 22.0中的极差分析和多因素方差分析功能对正交试验数据进行分析。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1液料比对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响（见图1）由图1可知，随着液料比升高，猴头菇菌渣多糖提取率先逐渐增大后略微下降。当液料比为20 mL/g时，猴头菇菌渣多糖提取率达到最高，为7.03%。因此，后续正交试验液料比水平选择15、20、25、30 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.F001图1液料比对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响2.1.2超声波功率对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响（见图2）由图2可知，随着超声波功率提升，猴头菇菌渣多糖提取率先逐渐升高后保持平稳。当超声波功率达到250 W时，多糖提取率最高，为6.76%。因此，后续正交试验中超声波功率水平选择200、250、300、350 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.F002图2超声波功率对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响2.1.3超声时间对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响（见图3）由图3可知，随着超声时间延长，猴头菇菌渣多糖提取率呈先升高后下降的趋势。超声时间为20 min时，猴头菇菌渣多糖提取率最高，为6.48%。因此，后续正交试验中超声时间水平选择10、15、20、25 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.F003图3超声时间对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响2.1.4超声次数对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响（见图4）由图4可知，随着超声次数增加，猴头菇菌渣多糖提取率呈先逐渐升高后逐渐下降的趋势。超声次数为4次时，多糖提取率最高，为6.01%。因此，后续正交试验中超声次数水平选择2、3、4、5次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.F004图4超声次数对猴头菇菌渣中多糖提取率的影响2.2正交试验和方差分析结果（见表2、表3）由表2可知，各因素对猴头菇菌渣多糖得率影响依据R值排序为液料比超声次数超声波功率超声时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T002表2正交试验结果项目ABCD多糖提取率/%平行1平行2均值111117.947.527.73212226.506.126.31313337.126.706.91414447.427.027.22521237.076.696.88622145.114.734.92723416.015.615.81824325.545.125.33931345.364.985.171032436.295.896.091133126.826.446.631234217.847.447.641341424.594.194.391442315.925.525.721543245.254.875.061644136.486.086.28K128.1724.1725.5626.90K222.9423.0425.8922.66K325.5324.4123.1326.16K421.4526.4723.5122.37k17.046.046.396.73k25.745.766.475.67k36.386.105.786.54k45.366.625.885.59R1.680.860.691.13由表3可知，液料比、超声波功率以及超声次数均对猴头菇菌渣多糖的提取率具有极显著影响（P0.01）；超声时间对菌渣多糖提取率具有显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值误差3.828190.201模型1 202.70611 202.7065 969.8390A13.13234.37721.7282.33×10-6B3.06431.0215.0699.55×10-3C2.95530.9854.8901.10×10-2D8.21832.73913.5975.68×10-5注：1.R²=0.877；F0.05（3，19）=3.13，F0.01（3，19）=5.01。2.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。综合表2和表3结果，以k值为依据，选择各影响因素中，k值最大的结果为最优参数水平，在猴头菇菌渣多糖的提取过程中，最优生产工艺参数为液料比15 mL/g、超声波功率350 W、超声时间15 min、超声次数2次。2.3最优工艺条件下猴头菇菌渣中多糖提取率（见表4）根据2.2中得到的最优工艺组合液料比15 mL/g、超声波功率350 W、超声时间15 min、超声次数2次，在该条件下进行6次重复试验，检测其猴头菇菌渣多糖的提取率。由表4可知，在最优提取生产工艺条件下，猴头菇菌渣多糖提取率达8.85%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T004表4最佳工艺参数条件下猴头菇菌渣多糖提取率项目123456平均值多糖提取率8.758.938.938.918.828.768.85%2.4猴头菇菌渣多糖的体外抗氧化活性2.4.1猴头菇菌渣多糖和VC对DPPH自由基的清除率（见表5）由表5可知，猴头菇菌渣多糖的质量浓度与其对DPPH自由基的清除率呈正相关，随着样品质量浓度增加，其DPPH自由基清除率随之提高，并呈先急剧上升后逐渐平缓的趋势。猴头菇菌渣多糖的质量浓度从0.025 g/L提高至0.100 g/L时，DPPH自由基的清除率从10.32%快速提升到71.28%；猴头菇菌渣多糖质量浓度为0.200 g/L时，对DPPH自由基清除能力（87.71%）最高。且猴头菇菌渣多糖的DPPH自由基清除率均高于同等质量浓度下的VC，表明猴头菇菌渣多糖对DPPH自由基清除效果较强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T005表5猴头菇菌渣多糖和VC对DPPH自由基的清除率项目样品质量浓度/(g/L)0.0250.0500.1000.2000.400猴头菇菌渣多糖10.3254.7371.2887.7188.03VC3.4912.3625.4963.3179.64%2.4.2猴头菇菌渣多糖和VC对超氧阴离子自由基的清除率（见表6）由表6可知，猴头菇菌渣多糖提取物对超氧阴离子自由基的清除率随着其质量浓度的增加而提高。当猴头菇菌渣多糖质量浓度为0.400 g/L时，对超氧阴离子自由基清除率达到最大（67.42%），低于同等浓度下VC的清除率。同等质量浓度下，猴头菇菌渣多糖对超氧阴离子自由基清除率均低于VC，但差距较小，表明猴头菇菌渣多糖对超氧阴离子自由基的清除能力与VC相近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T006表6猴头菇菌渣多糖和VC对超氧阴离子自由基的清除率项目样品质量浓度/(g/L)0.0250.0500.1000.2000.400猴头菇菌渣多糖31.3641.4845.3455.5967.42VC35.0143.1947.9861.4975.61%2.4.3猴头菇菌渣多糖和VC对ABTS+自由基的清除率（见表7）由表7可知，猴头菇菌渣多糖提取物对ABTS+自由基的清除率随着其质量浓度的增加而提高，呈先急剧升高后逐渐平缓的趋势。当猴头菇菌渣多糖质量浓度为0.25~1.00 g/L时，ABTS+自由基清除率急剧升高，但均低于VC清除率；当猴头菇菌渣多糖质量浓度为2.0~4.0 g/L时，其对ABTS+自由基清除率的提升逐渐放缓，并与VC清除率逐渐接近，均接近100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.018.T007表7猴头菇菌渣多糖和VC对ABTS+自由基的清除率项目样品质量浓度/(g/L)0.250.501.002.004.00猴头菇菌渣多糖37.4966.1279.3585.1697.83VC78.9086.3592.6795.4198.15%3讨论本研究结果显示，影响猴头菇菌渣中多糖提取率的4个因素排序为液料比超声次数超声波功率超声时间；最优工艺参数组合为液料比15 mL/g、超声波功率350 W、超声时间15 min和超声次数2次；在最优工艺组合条件下，猴头菇菌渣中多糖的提取率为8.85%。叶俊等[25]利用超声波法对猴头菇粉中多糖提取最佳工艺参数进行了研究，结果显示，最优工艺参数组合为液料比15 mL/g、超声功率300 W、超声时间15 min、超声次数2次，该条件下猴头菇粉中多糖提取率达16.96%。王锋等[26]利用超声法对猴头菇菌丝体中的多糖进行提取工艺优化研究，结果显示，最佳工艺参数为液料比15 mL/g、超声功率200 W、超声时间10 min、超声次数为3次，该条件下猴头菇菌丝体多糖的提取率为4.12%。樊伟伟等[27]利用超声法提取猴头菇多糖，采用响应面分析法得到优化后的最佳工艺参数为液料比11 mL/g、超声功率413 W、超声时间11 min，该工艺条件下猴头菇多糖提取率为6.22%。本研究得到的最优工艺参数组合与上述研究结论基本一致，表明在对猴头菇及其相关产物的多糖提取过程中，超声波法可有效提高多糖产量。有研究表明，超声波法提取猴头菇多糖不会破坏多糖原有的结构[28]。但不同研究中多糖提取率差异较大，可能是由于不同研究中所使用的研究材料不同导致。本试验主要研究材料为猴头菇菌渣，是食用菌生产过程中产生的废渣，其中包括多糖、蛋白质和膳食纤维在内的各种营养物质的含量相对较低，因此其产量也相对较低。本研究中正交试验结果显示，液料比、超声波功率以及超声次数均对猴头菇菌渣多糖的提取率具有极显著影响；超声时间则对其提取率具有显著影响。因此，在开展猴头菇菌渣多糖提取生产前应进行详细的试验和比较，以确定各影响因素的最优工艺参数水平，进而确保获得最高的产量；还可以采用响应面分析法进一步改进本研究所得工艺参数，以获得各影响因素更精确的工艺参数水平[29-30]。本研究结果显示，猴头菇菌渣多糖具有一定抗氧化能力，对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基的清除率分别为88.03%、67.42%和97.83%，均表现出明显的剂量依赖效应。上述结果表明，从猴头菇菌渣中提取得到的多糖在动物保健和抗氧化等方面均有较好的效果。因此利用猴头菇菌渣生产饲用多糖作为一种新型天然抗氧化剂具有良好的开发前景。4结论本研究发现，影响猴头菇菌渣中多糖提取率的4个因素排序为液料比超声次数超声波功率超声时间，优化后的生产多糖工艺最优参数组合为液料比15 mL/g、超声波功率350 W、超声时间15 min、超声次数2次。在此工艺条件下，猴头菇菌渣多糖提取率为8.85%。体外抗氧化试验显示，猴头菇菌渣多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和ABTS+自由基均有较好的清除效率，具有较好的抗氧化性。