腹泻是动物养殖过程中最常见疾病之一，由于营养不良、细菌、病毒、寄生物等造成的长期反复腹泻常并发或继发炎症性肠病（IBD）[1]。IBD累及回肠、直肠、结肠，常见表现为腹泻、腹痛、里急后重、血便等[2]，由于病因不明，根治较为困难，必须终身治疗[3]。IBD易导致发病动物肠道损伤、腹泻和发育迟缓，病情严重还可致死，对动物健康、动物福利、经济效益均产生不利影响[4]。自2020年起，我国饲料全面禁止添加抗生素[5]，因此寻找和开发有效的绿色饲料添加剂和药物至关重要。许多中草药是药食同源的植物，兼具营养价值和药理活性，能够提高动物生长性能、免疫力、抗病力和畜产品品质[6]。并且中草药治疗IBD具有较好的抗炎药理作用和较高的接受度，因而受到越来越多的关注和研究[7]。细胞自噬功能失调是许多慢性炎症性疾病的促成因素，包括IBD[8]。研究表明，病患体内病灶部位细胞自噬异常加剧了IBD的病理进程[9]，调节自噬可作为IBD治疗的新靶点。对IBD治疗有效的中药活性成分可不同程度地参与自噬调控过程，可能通过调节自噬发挥IBD的治疗作用[10]。因此，有必要探索中药通过调控细胞自噬治疗IBD的新策略。阿魏属为伞形科前胡族，该属有多种药用植物，我国有25种1变种，主要产自新疆[11-12]。阜康阿魏为伞形科芹亚科前胡族阿魏属多年生一次性结实植物，为阜康特有物种[11]。阜康阿魏具有显著的抗炎和免疫调节作用，被长期用于治疗腹胀、胃炎、胃溃疡和消化不良等多种常见胃肠消化系统疾病和类风湿性关节炎的药物[12]，具有消积、化症、散痞、杀虫的功效，可用于肉食积滞、瘀血症瘕、腹中痞块、虫积腹痛[13]，也可治疗痢疾、肠炎等疾病[14]。阿魏虽然作为重要的治疗胃肠疾病的中药，但其功效尚未得到证实。此外，验证植物药的效果不仅要考虑每种成分的作用，还要考虑多种成分之间的协同作用。网络药理学是基于公共数据库和公开数据，从生物网络平衡的角度发现生物活性成分、预测药物作用靶点、分析药物作用机制的一种新颖、有前景且具有成本效益的方法[15]。与实验药理学方法相比，网络药理学强调信号通路的多通道调控，因此特别适合解释具有多种化学成分和分子靶点的中药的作用机制[16]。本文应用网络药理学方法分析阿魏调控细胞自噬治疗IBD的有效成分，预测发挥作用的核心靶点和通路，并通过分子对接对这些靶点进行初步验证，可为干预治疗IBD提供新思路，还可为开发阿魏作为绿色环保型饲料添加剂或药物调控IBD提供参考。1材料与方法1.1网络药理学分析1.1.1阿魏潜在活性成分筛选在中药系统药理学（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/）数据库中未能发现阿魏的任何信息。因此，本研究通过查阅已发表的与阿魏相关的文献对其化学成分进行了汇编。这些化合物的分子结构通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）平台验证并导出。检索文献获取阿魏已知化学成分，并将从PubChem平台获得的阿魏化合物的化学结构在SwissADME（http://www.swissadme.ch/）数据库中预测，使用SwissADME平台中所得化合物的药代动力学和DL作为筛选潜在活性成分的指标。药代动力学中的“高”胃肠道吸收（GI吸收）是筛选标准之一，DL的结果以“是”或“否”表示，表明该分子是否被定义为类似的药物。至少有两个筛选结果为“是”的化合物可被认为是具有潜在活性的成分[17]。1.1.2阿魏潜在活性成分靶点预测在PubChem数据库中查找阿魏潜在活性成分的标准Smiles号[18]，将从PubChem平台获得的化合物的化学结构导入Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget predict.ch/）平台，纳入所有具有概率值的靶点基因[19]。1.1.3IBD、细胞自噬靶点预测以“Inflammatory bowel disease”为关键词，从GeneCards、OMIM数据库中整理与IBD相关的潜在靶点。之后将两个不同疾病数据库中确定的靶点进行合并，去除重复值以获得与IBD相关的靶点。HAMdb数据库（http://hamdb.scbdd.com/home/index/）整合HADb、autophagy database等数据库、文献报道中自噬相关疾病、通路和自噬相关调节分子的全面信息[20]。从此数据库中筛选了与细胞自噬相关的靶点。1.1.4“阿魏-活性成分-靶点基因-细胞自噬-IBD”网络的构建在Venny2.1.0中将预测出的阿魏潜在活性成分靶点与IBD靶点、细胞自噬靶点进行映射，得到重叠靶点。采用Cytoscape3.9.1构建“阿魏-活性成分-靶点基因-细胞自噬-IBD”网络。1.1.5蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建将重叠靶点引入String网络平台（https://STRING-db.org/），构建PPI网络，置信度设置为中等（0.400），输出网络。同时，将String中下载的tsv文件依托Cytoscape3.9.1构建阿魏调控细胞自噬治疗IBD相关的蛋白互作关系网络。1.1.6GO、KEGG富集分析应用R语言中的clusterprofiler包对重叠靶点进行GO、KEGG富集分析，这一过程对所涉及的重叠靶点富集，产生了主要的生物学过程和信号通路。基于KEGG富集通路上的靶点，利用Cytoscape3.9.1构建了一个“成分-靶点-通路”网络，该网络有助于科学解释化合物、靶点基因、通路和疾病之间的复杂关系。根据网络拓扑参数确定了发挥药物作用的核心靶点和主要活性化合物[21]。1.2分子对接验证分子对接主要用于小分子与目标蛋白的结构对接，并评价其与定义的结合位点的结合亲和力[22]。负的对接结合表明小分子可有效地与目标蛋白自主结合，配体与受体结合的构象的能量越低，该效应就越可能发生。本文使用分子对接的方法，观察网络药理学鉴定的阿魏主要活性成分是否与核心蛋白结合。使用PubChem数据库下载主要活性化合物的结构图，以SDF格式保存。使用Open Babel软件将SDF格式转换为PDB格式；使用蛋白质数据库（protein data bank，PDB）（https://www.rcsb.org/）下载排名前4位的核心靶基因编码的蛋白质的3D结构，作为蛋白质受体，并以PDB格式保存，之后导入AutoDock Vina1.2.0软件进行分子对接。配体与受体的结合能力由结合能评价。若结合能小于0，表明配体与受体能自发结合，值越小，结合活性越高。2结果与分析2.1阿魏潜在活性成分及预测靶点（见表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.T001表1阿魏的活性成分及类药信息序号PubChem CID中文名称英文名称类药性F1438586100β-谷甾醇BETA-SITOSTEROLFive“yes”F21781413伞形花素UmbellipreninTwo“yes”F32355佛手柑内酯Bergaptenthree“yes”F43220大黄素Emodintwo“yes”F58384对羟基苯甲酸乙酯Ethylparabenfour“yes”F6445858阿魏酸Ferulic acidtwo“yes”F75284507橙花叔醇Nerolidolthree“yes”F8227829愈创醇Guaiolfour“yes”经过文献挖掘整理阿魏的潜在活性成分，并在Swiss ADME数据库进行筛选，最终得到阿魏相关成分共8个。再根据8个成分进行靶点预测，获得344个预测靶点。2.2IBD及细胞自噬靶点的获取通过合并GeneCards、OMIM结果，之后删除重复值，对最终的目标列表进行整理，共纳入6 476个与IBD相关的靶点。从HAMdb数据库中获取细胞自噬靶点797个。利用Venny 2.1.0软件将3个靶点集结合，绘制Venn图，共获得44个共同靶点（见图1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F001图1阿魏与IBD及细胞自噬交集基因Venn图2.3“阿魏-活性成分-靶点基因-细胞自噬-IBD”网络的构建（见图2）由图2可知，将2.2获得的44个共同靶点导入Cytoscape.3.9.1软件，绘制网络图，红色长方形为疾病，绿色菱形为药物阿魏，紫色箭头为阿魏的活性成分，蓝色三角形为细胞自噬，黄色圆形为活性成分对应的作用靶点。阿魏有8个活性成分对应44个作用靶点与治疗IBD及细胞自噬有关，表明阿魏治疗IBD时，多个活性成分、多个靶点可能具有协同作用调控自噬抗IBD。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F002图2“阿魏-活性成分-靶点基因-细胞自噬-IBD”网络2.4PPI网络构建与分析通过String数据库对共同靶点进行蛋白-蛋白相互作用分析，共涉及44个节点和293条边。利用Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络图，舍去1个断开无连接节点（PTGER2），其中度值（Degree）越大，节点颜色越深，表明在网络中越重要。PPI网络见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F003图3PPI网络2.5GO、KEGG功能富集分析（见图4）图4GO、KEGG功能富集分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F4a1（a）GO富集分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F4a2（b）KEGG功能分析应用R语言中的clusterprofiler包对获得的这些共同靶点进行进一步的GO和KEGG富集分析。对GO富集条目按照Q value进行排序，分别选取生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）中排名前10的条目绘制条形图。由图4（a）可知，BP涉及肽酰丝氨酸修饰、化学应激反应、氧化应激反应等方面；CC涉及转录调节复合物、内溶酶体、核包层等部分；MF涉及丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等方面。由图4（b）可知，按照Q value筛选了前20条信号通路，涉及PI3K/AKT信号通路、细胞凋亡通路、黏着斑连接及癌症相关通路等。2.6“成分-靶点-通路”网络的构建根据KEGG分析结果，将筛选出的前20条通路作为关键通路，使用Cytoscape3.9.1软件绘制阿魏治疗IBD“成分-靶点-通路”网络（见图5）。在图5中，绿色四边形代表成分，黄色圆形节点代表靶点，紫色不规则四边形节点代表关键通路。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F005图5“成分-靶点-通路”网络由图5可知，经网络拓扑分析，图中节点的大小与节点的度值成正比，选取度值排前三的化合物为主要活性成分，分别为伞形花素、阿魏酸、橙花叔醇，选取度值排前四的靶点为核心靶点，分别为PIK3CA、RELA、NFKBI和BCL2。2.7分子对接将2.6中筛选出的主要活性成分与核心靶点分别进行分子对接，结合能≤-5 kcal/mol，表明具有良好的结合活性。主要活性成分与核心靶点的结合热图见图6。由图6可知，除橙花叔醇与NFKB1外均具有良好的结合活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F006图6主要活性成分与核心靶点的结合热图通过PyMol软件进行可视化分析，结果见图7。结果显示，这3种主活性化合物在治疗IBD方面发挥了重要作用。图7分子对接模式图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F7a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F7a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F7a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.011.F7a43讨论通过文献检索及数据库挖掘进行的网络药理学研究，确定伞形花素、阿魏酸、橙花叔醇为阿魏调控细胞自噬治疗IBD的主要活性化合物，并且可能与PIK3CA、RELA、NFKB1和BCL2等靶点发生相互作用，作用于PI3K/AKT信号通路、细胞凋亡等自噬相关通路，还可能与黏着斑连接通路有关，预测了阿魏调控细胞自噬治疗IBD的主要机制。伞形花素、阿魏酸、橙花叔醇为“成分-靶点-通路”网络中的核心成分，可与网络中的多个靶点发生相互作用，表明其在治疗IBD过程中发挥重要作用。伞形花素是一种天然存在的倍半萜化合物，在阿魏属植物中被发现[23]。许多体外和体内试验研究表明，伞形花素具有抗氧化、抗炎作用，可抑制脂氧合酶并控制炎症反应[24-26]。也有研究表明，在炎症巨噬细胞中，伞形花素抑制了一氧化氮的产生以及诱导一氧化氮合酶[27]。阿魏酸为一种酚酸，在自然界植物中广泛存在。研究表明，阿魏酸具有抗菌消炎等作用[28]。在饲料中选择性添加适量的阿魏酸可作为改善动物肠道健康的一种营养策略[29]。橙花叔醇是一种广泛存在于多种植物中、具备多样药理作用及生物学活性的倍半萜烯醇。研究发现，橙花叔醇通过调节细胞信号通路，具有抗氧化、抗炎活性[30]。由分子对接结合能可知，伞形花素、阿魏酸、橙花叔醇与4个核心靶点蛋白的结合程度均较为稳定，推测以上3个成分有抗炎活性，且也有文献报道证实其抗炎作用。综上所述，阿魏是一个多组分、多靶点的具有抗炎作用的中草药，通过深入研究其与IBD之间的关系，将其作为治疗IBD的药物具有广阔前景。KEGG通路富集分析表明，阿魏治疗IBD与PI3K/AKT信号通路及细胞凋亡等自噬相关通路有关，还可能与黏着斑连接通路有关。PI3K/AKT信号通路高度富集，且核心靶点PIK3CA、RELA、NFKB1和BCL2皆富集在PI3K/AKT信号通路上[31]，推测该通路是阿魏通过调控细胞自噬治疗炎症性肠病的主要信号通路。自噬受多种信号通路调控，PI3K/Akt信号通路作为经典通路，参与细胞生长、增殖、自噬、凋亡等多种生物过程[32]。有研究发现，PI3K/Akt信号通路可通过磷酸化激活下游复合物，广泛参与细胞自噬及凋亡等[33]。PI3K激活后能够磷酸化细胞内的肌醇脂质，磷酸化底物3, 4, 5三磷酸磷脂酰肌醇可与Akt结合，活化的Akt进一步与TSC1/2复合物结合，导致下游分子m-TOR激活，从而调控自噬[33]。由于自噬和凋亡呈负相关，当自噬被激活时会抑制细胞凋亡，这也是中药活性物通过激活自噬、发挥抗炎的潜在治疗作用机制[34]。另有研究发现，PI3K/Akt通路可以抑制细胞凋亡[35]、促进细胞增殖进而修复肠道黏膜的损伤[36]，预测出的黏着斑信号通路可能发挥重要作用。肠上皮屏障功能受损一直被认为是IBD的病理机制之一，肠屏障的损伤可改变肠道的免疫系统和代谢，进而引发炎症性肠病。肠上皮屏障由各种细胞连接而成，其中黏着斑连接是这些细胞连接的重要组成部分，它们对肠上皮细胞之间的连接起到关键作用[37]，一般在炎症溃疡伤口愈合期间，细胞的黏着斑信号极大地影响了细胞的迁移活动，促进了伤口的愈合[38]。4结论阿魏调控细胞自噬治疗IBD的物质基础是基于伞形花素、阿魏酸、橙花叔醇等活性化合物，其作用机制具有多靶点、多通路的特点。阿魏可能通过抑制PI3K/Akt信号通路激活细胞自噬，抑制细胞凋亡，进而促进细胞增殖，通过黏着斑信号通路修复肠道黏膜的损伤，从而改善肠黏膜微循环，逆转IBD恶化发展。