猪的肠道由单层肠上皮细胞组成，用于输送和消化食物，可以直接与外界物质相接触，具有很强的韧性，是各种有害物质、病原体侵入的主要途径。在猪体内，肠道发挥着消化吸收、神经调节和免疫防御的作用。维持肠道功能的完整性对保障动物机体健康、提高饲料转化率、发展养殖业具有重大意义[1]。肠道屏障的完整性有利于肠道的健康[2]。肠道屏障作为抵御病原体入侵的一道防线，可以抵御有害的物质的侵入，维持肠道的稳态[3-4]。肠道屏障受到损伤会导致肠道选择性降低、通透性增加，同时也会引起黏膜和全身炎症反应，从而引发各种肠道疾病。Occludin基因编码的蛋白质是一种紧密连接（TJ）蛋白，称为闭合蛋白或咬合蛋白，是第1个被发现的膜内紧密连接蛋白，是构成肠道屏障完整性、决定肠道通透性的重要蛋白分子[5]。Occludin蛋白对肠道具有保护作用并且可以促进猪体内肠道形态和肠道屏障完整性的更新。Occludin基因在细胞膜上的表达具有广泛性，可在机体上皮和内皮组织中被检测到。Occludin基因在细胞间主要发挥黏附分子的作用，能够维持细胞间的紧密连接以及紧密连接屏障的功能。Occludin基因序列相对保守，在生物进化过程中变异较小，对生物体的生存具有重要的意义[6]。1肠道屏障的构成肠道屏障的结构包括正常的肠道菌群、黏液层、肠上皮细胞层以及肠道的免疫系统。肠道屏障功能包括机械屏障、生物屏障、免疫屏障、化学屏障[7]。其中，机械屏障是肠道屏障功能的基础，该屏障只允许水分子和小分子水溶性物质有选择性通过，能够抑制细菌移位、防治肠源性感染；微生态系统平衡形成了肠道的生物屏障，能够对肠道中的致病菌进行竞争抑制，阻止致病菌在肠道上皮细胞的定植和生长；肠道的化学屏障是指胃肠道所产生的多种化学物质对病原菌的黏附定植起一定的作用；在免疫屏障功能中，TJ在维持肠道上皮细胞结构完整、维护肠道屏障功能、阻止细菌内毒素及毒性大分子的侵入方面起重要的作用[8]。如果肠道屏障功能受到损伤，容易导致猪的营养吸收受阻[9]、免疫力低下[10]、生长性能下降[11]，进而给养猪业带来经济损失。2紧密连接概述在肠道内，TJ构成了肠道重要的保护屏障。TJ是一种广泛存在于细胞间连接多种蛋白质的复合物的高度特化的膜结构域，主要位于肠道上皮细胞周围，可用来封闭细胞间的缝隙，使上皮细胞的间隙被完全封闭，维持细胞的紧密排列。该过程是一个动态平衡的过程，也是邻近细胞间离子、溶质和水分通过旁路运输的结构与功能的基础[12]。TJ具有栅栏功能和屏障调节功能。栅栏功能可以防止膜蛋白在顶端和基底侧膜之间的混合；屏障调节功能可以控制细胞旁离子和溶质在细胞间的转运[13]。紧密连接蛋白是肠道屏障功能的重要组成部分，在肠道中紧密连接蛋白的完整性受损，会导致肠道屏障功能受损[7]。因此，紧密连接蛋白功能的完整性关系整个肠道的屏障功能。在外来微生物入侵肠道时，TJ可以将其阻止在肠道的黏液层，防止微生物进入血液循环引发肠道疾病。3紧密连接蛋白的分类跨膜蛋白Occludin、Claudin和细胞质支架蛋白ZO-1、ZO-2和ZO-3构成TJ。3.1跨膜蛋白Occludin3.1.1Occludin蛋白的结构及生物信息Occludin是分子量为65 kD的4次跨蛋白，具有2个细胞外环。Occludin基因CDS全长1 569 bp，共编码522个氨基酸，其氨基端和羧基端都在细胞质中。通过Expasy网站查找该基因编码蛋白质的理化性质和亲疏水性。Occludin基因编码的蛋白质亲水/疏水曲线见图1。由图1可知，Occludin蛋白是不稳定的亲水性蛋白，由9个外显子编码。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.027.F001图1Occludin基因编码的蛋白质亲水/疏水曲线用Tmhmm网站预测Occludin基因跨膜结构，Occludin基因编码蛋白跨膜区的预测结果见图2。Occludin基因编码蛋白的跨膜螺旋数量为5，多肽链跨膜区位于氨基酸67~89、102~123、139~161、173~195、243~265位。该蛋白为跨膜蛋白，不存在信号肽。对Occludin二级结构进行预测，发现Occludin蛋白中α螺旋占37.36%、延伸链占8.81%、无规则卷曲占50.38%。使用Swiss-Model网站预测Occludin基因编码蛋白质的三级结构，Occludin基因编码蛋白质的三级结构见图3。由图3可知，Occludin基因编码蛋白质的三级结构是由多个二级结构单元连接在一起形成具有紧密形态的三维空间结构。对Occludin基因的生物信息学分析，可以为深入研究Occludin基因在猪肠道屏障中的作用提供参考。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.027.F002图2Occludin基因编码蛋白跨膜区的预测结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.027.F003图3Occludin基因编码蛋白质的三级结构3.1.2Occludin蛋白的生物学功能Occludin蛋白的生物学功能包括保持细胞极性、调节细胞间的黏附性、接受和传递细胞信号等[14]。Occludin介导的上皮-间质间隙被Occludin所封闭，构成了体内的渗透性屏障，从而维持了细胞内外的物质差别，维护了体内正常的生理功能。Occludin蛋白的主要生物学功能是栅栏功能和细胞旁屏障调节功能[15]。栅栏功能是将上皮细胞质膜分为蛋白和脂质两个部分，能够阻止不同功能区之间的相互作用，帮助维持细胞间不同的形态和功能，从而形成蛋白与分子侧向扩散的屏障，保证细胞的正常生理机能。屏障调节功能指的是形成机体渗透性屏障，对不同的分子、离子和细胞具有选择透过性，阻止蛋白质和大分子物质从上皮细胞的一侧扩散到另一侧，能够调控小分子在细胞之间的运输，维持各细胞间稳态[16]。Occludin蛋白还具有维持细胞信息传递，联系细胞转运囊泡等重要功能。Occludin蛋白也可以和其他的信号途径发生交互作用，是重要的信号分子[17]。3.1.3Occludin蛋白调控机制Occludin蛋白的调控机制包括磷酸化和非磷酸化。磷酸化Occludin蛋白是一种活性形式，主要集中分布在TJ内，而TJ的定位主要受上皮和内皮细胞磷酸化调控[13]；非磷酸化Occludin蛋白主要位于基底外侧膜和细胞质囊泡中。Occludin蛋白的磷酸化调控机理比较复杂，Occludin在酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上存在多个磷酸化修饰位点[18]，且磷酸化Occludin蛋白受蛋白激酶（PK）和蛋白磷酸酶（PP）调控[19]。该过程涉及多条调节途径，以保证Occludin蛋白精确定位到TJ上。3.2跨膜蛋白Claudin在哺乳动物中已经发现27种Claudin蛋白，范围在20~27 kDa，Claudin蛋白家族拥有４个疏水跨膜结构域及多个磷酸化位点和结合区域，其Ｎ端和Ｃ端位于细胞质中，形成2个细胞外环和1个细胞内[20]。Claudin蛋白可以构成一道屏障，使TJ周围的细胞处于密封状态，还能够形成为TJ细胞提供可渗透的通道。除Claudin12外，其他Claudin蛋白的胞内C端均以双肽序列结束，这段序列与盘状同源区域（PDZ）结构域蛋白的凹槽相结合。对此区域进行抑制不会对Claudin蛋白在TJ上的定位产生影响，但会对ZO-1、ZO-2和ZO-3蛋白的结合产生抑制作用[21]。Claudin与Occludin蛋白的第2个细胞外环和连接黏附分子相互作用，中断相互作用会抑制钙补充后TJ的重建[22]。3.3ZO蛋白ZO-1、ZO-2和ZO-3是膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族的成员，除了肌动蛋白的细胞骨架外，还与黏附蛋白和紧密连接蛋白结合。当Occludin蛋白中的酪氨酸磷酸化后，所有ZO蛋白与Occludin蛋白之间的相互作用会减弱[23]。ZO蛋白在TJ的形成中的作用并不局限于支架作用。ZO蛋白还可以作为细胞表面富集的黏附蛋白复合体（AJC）的组织，使Claudin蛋白在其棕榈酸化部位与高胆固醇膜间形成亲和力[24]。4猪肠道Occludin基因的影响因素在猪体内，Occludin基因的表达方式比较保守，但mRNA水平存在差异，说明该基因在不同的组织中的功能差异与其含量存在联系[5]。Occludin基因能够阻止肠道内的细菌、毒素等物质向细胞外转运，维持肠上皮屏障功能的完整性[5]。该基因低表达会引起肠道上皮细胞通透性增高，进而引发肠道疾病。在多重胁迫（如断奶、转群等）条件下，猪群容易遭受病菌的侵袭，引起肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的表达量下降和肠黏膜渗透性增加，从而诱发多种肠道疾病。通过营养调控等方法可以增加肠道紧密连接蛋白的表达，加强肠道上皮细胞的TJ，改善肠道屏障功能[8]。添加微生态制剂、氧化锌、维生素A等方法也可以上调Occludin基因表达，改善肠上皮细胞TJ，降低肠道上皮细胞通透性，增强肠道屏障功能，从而提高动物的免疫能力。4.1断奶对Occludin基因表达量的影响仔猪断奶可能出现肠道功能障碍、腹泻等症状。仔猪断奶后，腹泻会造成肠道结构的变化，如绒毛萎缩和隐窝增生，使断奶仔猪的生长滞后[25]。仔猪断奶会使空肠中ZO-1和Occludin蛋白的mRNA水平降低，结肠中炎症因子的mRNA水平提高[26]。仔猪早期断奶可以使Occludin基因在肠道屏障中的表达减少，促使肠道通透性增加，屏障功能受损，该状况到35日龄时会得到改善，但是与断奶前相比，Occludin表达量还是较低[27]。Occludin基因突变、缺失或表达下调均会引起肠道上皮细胞通透性改变，导致细菌、病毒等大分子通过TJ进入机体内。4.2冷、热应激对Occludin基因表达量的影响每年的冬、春季，冷应激造成猪群的病毒性腹泻以及其他腹泻疾病的发生[28]，对仔猪的胃肠消化系统造成损伤，使胃肠屏障功能的完整性降低，猪肠道中Occludin基因的表达量下降，幼龄仔猪死亡率增加。研究冷应激对仔猪肠道的影响能够进一步理解冷应激和肠道疾病之间的内在关系，找到预防冷应激的有效方法[29]。热应激可以导致肠道屏障受损和肠道炎症，是炎症性肠道疾病发生的重要诱因。当环境温度超过猪热中性区的上限时，会导致猪体出现热应激，对猪的健康造成危害。高温胁迫可以引起肠道渗透性增高，导致肠上皮细胞的紧密连接的损伤[30]。热应激使猪肠组织完整性受损，引起猪肠道微生物多样性及结构的改变，使紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin1和Claudin2的表达量下调，这是热应激损伤肠道屏障功能的重要原因[31]。4.3微生态制剂对Occludin基因表达量的影响微生态制剂作为新型饲料添加剂具有绿色、安全和高效等特点[32]。微生态制剂能够维持机体的健康。将微生态制剂添加到饲料中，可以获得与抗生素相似的效果。微生态制剂经过特殊的方法处理而成，具有维护肠道屏障的完整、保持肠道菌群的相对平衡、增强肠道的免疫功能等作用[33]。乳酸菌类微生态制剂能够保持新生仔猪肠道菌群的平衡，从而提升免疫球蛋白的浓度和肠道屏障功能[34]。余婕等[35]研究表明，在断奶仔猪的饲粮中加入酶类和微生态制剂，能够提高紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，表明酶类和微生态制剂可以增强肠道黏膜的防御屏障功能。李雪莉等[36]研究发现，在断奶仔猪的饲粮中加入植物乳杆菌可以提高空肠、回肠中的Occludin mRNA表达量。微生物制剂能够调节肠道菌群，增强肠道免疫功能，增强Occludin基因的表达。4.4抗营养因子对Occludin基因表达量的影响大豆是优质的蛋白质来源，大豆中的抗营养因子（ANF）主要包括β-甘氨酸（β-CG）、甘氨酸、凝集素以及胰蛋白酶抑制剂[37]。β-甘氨酸（β-CG）是重要的抗营养因子和致敏蛋白。β-CG可以引起仔猪肠道功能紊乱，导致仔猪肠道功能下降，肠道中Occludin基因表达下降，肠道自噬水平升高[38]。降低大豆中β-CG的含量是提高猪日粮中豆类产品用量的有效措施。大豆凝集素（SBA）作为重要的抗营养因子，会影响畜禽肠道的结构与功能，进而影响畜禽对大豆蛋白质的利用率。SBA会导致细胞间Occludin基因和claudin-3基因的表达量下降，削弱肠道的机械屏障功能[39]。高浓度SBA能够与肠上皮细胞相结合，从而减少肠上皮Occludin基因表达，使肠黏膜通透性增加[40]。4.5氧化锌对Occludin基因表达量的影响高浓度的氧化锌能够控制仔猪腹泻，促进仔猪的生长发育，减轻仔猪断奶的应激反应。刘汉锁等[41]研究发现，与普通氧化锌组比较，纳米氧化锌组仔猪的空肠Occludin基因表达量高于常规氧化锌组。Zhang等[42]研究发现，在日粮中添加氧化锌可以提高猪肠道中Occludin和ZO-1基因的表达量，减轻猪肠道组织损伤。Dokladny等[43]研究发现，ZO-1、Occludin和Claudin基因可以保持肠道上皮屏障的完整，阻止病原微生物的入侵。宿志民[44]研究发现，在饲粮中添加纳米氧化锌可以提高锌的利用率，降低仔猪腹泻率，提升仔猪的生长性能。氧化锌可以改变仔猪肠道中的紧密连接蛋白的表达，促使仔猪肠道上皮细胞中TJ的形成，进而改善肠道的屏障功能，提高仔猪的免疫力。4.6维生素A对Occludin基因表达量的影响维生素A对肠道环境和各器官的免疫功能具有重要意义[45]。杨菊等[46]研究发现，0.1~10 μmol/L的维生素A通过保护细胞活力和细胞完整性，影响紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin蛋白的mRNA表达，进而改善肠道屏障功能。贺彩梅[47]研究发现，维生素A能够提高紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达，减轻由脂多糖（LPS）引起的肠道炎症反应。不同浓度的维生素A（0~2 μmol/L）上调肠道组织紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin蛋白mRNA水平的表达，对十二指肠的作用较为明显。因此，维生素A可以保护肠黏膜的结构蛋白。5结论肠道屏障被破坏会导致肠道通透性增加，加快有害物质及病原体的入侵，引起各类肠道疾病。Occludin基因编码的蛋白质可以创造细胞转运屏障，调控细胞膜的通透性。但该基因表达异常时会影响细胞膜的完整，改变细胞膜通透性，导致肠道疾病和系统性疾病发生。因此，Occludin基因的正常表达对机体健康具有重要意义。