一定水平的尿酸可在动物机体内发挥重要作用，但尿酸过高会引发一系列的疾病[1-2]。高尿酸血症是一种以血清尿酸水平异常升高为特征的疾病，除了引发痛风外，还会导致家禽精神沉郁、食欲不振、产蛋率下降和死亡率上升等临床症状[3]。体内含有尿酸氧化酶的动物几乎不会发生高尿酸血症，而灵长类和鸟类体内因缺乏尿酸氧化酶[4]，更易发生高尿酸血症。降低血液尿酸水平是治疗禽高尿酸血症的主要方法，可通过减少尿酸的生成、增加尿酸的排泄实现[5]。在尿酸代谢的过程中，离不开酶的参与，其中黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶在尿酸代谢的过程中具有重要作用，黄嘌呤氧化酶抑制剂可以阻止尿酸的产生，尿酸氧化酶可以促进尿酸的分解，从而降低血清尿酸水平[6]，使肠道的尿酸和血液的尿酸处于一个动态的平衡状态[7]。目前，从自然界中筛选产尿酸氧化酶的菌株成为治疗高尿酸血症的研究新方向。Zhao等[8]研究表明，高产尿酸氧化酶菌株可降低机体血清尿酸浓度。叶泽[9]筛选出能够降解尿酸的乳酸菌，其能够在小鼠体内定植，缓解高尿酸血症对肾脏的损伤，降低部分炎症因子水平。本研究拟从鸭粪便中筛选高产尿酸氧化酶菌株，预期发挥尿酸氧化酶作用，降低肠道中尿酸的浓度，促进体内尿酸的排泄，为缓解和治疗家禽的高尿酸血症提供参考。1材料与方法1.1试验材料新鲜粪便样品采自武汉市农业科学院种鸭场的健康肉鸭，4 ℃保存。羧甲基纤维素钠、腺嘌呤购自上海麦克林生化科技有限公司，盐酸乙胺丁醇购自杭州民生药业有限公司，尿酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2主要试剂LB培养基：蛋白胨10 g、氯化钠5 g、酵母膏10 g、加双蒸水至1 000 mL，调节pH值至7.2，若为固体培养基另加入15 g琼脂，高压灭菌。富集培养基：尿酸5 g、酵母膏0.5 g、氯化钠0.5 g、硫酸镁0.5 g、磷酸氢二钾6.5 g、磷酸氢钾0.5 g，加双蒸水至1 000 mL，调节pH值至7.4，高压灭菌。筛选培养基：尿酸3 g、酵母膏0.5 g、氯化钠0.5 g、硫酸镁0.5 g、磷酸氢二钾6.5 g、磷酸氢钾0.5 g、琼脂15 g、加双蒸水至1 000 mL，调节pH值至7.4，高压灭菌。蛋白琼脂：称取酪蛋白琼脂粉末（青岛海博生物技术有限公司）35.0 g，加双蒸水至1 000 mL，调节pH值至7.4，高压灭菌。淀粉水解培养基：称取淀粉培养基粉末（青岛海博生物技术有限公司）63.0 g，加双蒸水至1 000 mL，调节pH值至7.2，高压灭菌。1.3菌株筛选1.3.1产尿酸氧化酶菌株的初筛在无菌超净台中，称取1 g新鲜采集的鸭粪便样品，加入200 mL无菌生理盐水充分混匀，室温静置后取上清液2 mL加入至100 mL富集培养基中，37 ℃、200 r/min恒温摇床培养24 h。采用比浊法调整菌液浓度为104、103、102 CFU/mL，吸取100 μL菌液至筛选培养基上，均匀涂布，37 ℃静置培养至可见明显菌落。挑取周边有透明圈的单菌落，采用LB培养基进一步分离纯化。纯化后的菌株在LB液体培养基37 ℃培养过夜，调整菌液浓度至105 CFU/mL，使用无菌牙签蘸取待测菌液点种于产尿酸氧化酶菌株筛选培养基上，每菌株接种6个点，37 ℃静置培养24 h；测量透明圈直径（H）和菌落直径（C），计算H/C值。1.3.2筛选菌株产蛋白酶、淀粉酶能力测定采用点种法测定筛选菌株产蛋白酶、淀粉酶能力。取纯化菌株用LB液体培养基37 ℃培养过夜，调整菌液浓度至105 CFU/mL，使用无菌牙签蘸取待测菌液分别点种于酪蛋白培养基和淀粉水解培养基上，每菌株接种6个点，37 ℃静置培养24 h。测量透明圈直径（H）和菌落直径（C），计算H/C值。1.3.3筛选菌株形态学观察使用接种环从筛选的平板中蘸取菌落，以划线法接种至LB平板中，转入37 ℃培养箱培养24 h。按单菌落大小、形状、颜色、透明度、边缘整齐度、表面粗糙度等分类；采用接种环挑选单菌落进行革兰氏染色，显微观察。1.3.4PCR扩增及16S rDNA测序采用细菌基因组DNA提取试剂盒法提取候选菌株DNA，以候选菌株基因组DNA为模板，进行16S rDNA基因PCR扩增，产物送武汉擎科生物科技有限公司测序，分析序列，构建细菌系统发育树。1.4候选菌株饲用效果1.4.1试验设计及试验管理根据前期试验结果，初筛2株作为候选菌株，进行饲用效果的观测。选取21日龄体重均匀的健康樱桃谷鸭24只，随机分为3组，每组4个重复，每个重复2只鸭。空白组樱桃谷鸭饲喂基础日粮，AS1组、P56组樱桃谷鸭分别饲喂拌有AS1、P56菌株的饲料（2.1×109 CFU/kg），连续饲喂4 d。试验鸭自由采食和饮水。每日观察鸭精神状况、粪便颜色，记录死亡情况。基础日粮为湖北农腾畜牧科技有限公司的肉用仔鸭中期配合饲料，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米68.00代谢能/(MJ/kg)11.18小麦次粉9.50粗蛋白/%14.76豆粕18.00粗纤维/%2.64食盐0.50粗灰分/%5.14磷酸氢钙1.50钙/%0.89碳酸钙1.50总磷/%0.60预混料1.00赖氨酸/%0.92蛋氨酸/%0.57注：1.预混料购自湖北农腾畜牧科技有限公司。2.营养水平是计算值。1.4.2生长性能试验开始和结束时，各组试验鸭称重、记录饲料消耗，计算平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.5候选菌株降尿酸能力评估1.5.1试验设计选取21日龄体重均匀的健康樱桃谷鸭60只，随机分为6组，每组5个重复，每个重复2只鸭，分别为空白对照组（CON）、高尿酸模型组（AE）、菌株饲喂组（AS1、P56）和高尿酸模型+菌株饲喂组（AE-AS1、AE-P56）。试验各组处理方法及饲喂日粮见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.T002表2试验各组处理方法及饲喂日粮组别处理饲料CON组0.5%羧甲基纤维素钠基础日粮AE组腺嘌呤750 mg/kg BW+乙胺丁醇125 mg/kg BW基础日粮AS1组0.5%羧甲基纤维素钠基础日粮+AS1菌株（2.1×109 CFU/kg）AE-AS1组腺嘌呤750 mg/kg BW+乙胺丁醇125 mg/kg BW基础日粮+AS1菌株（2.1×109 CFU/kg）P56组0.5%羧甲基纤维素钠基础日粮+P56菌株（2.1×109 CFU/kg）AE-P56组腺嘌呤750 mg/kg BW+乙胺丁醇125 mg/kg BW基础日粮+P56菌株（2.1×109 CFU/kg）1.5.2试验方法采用16号灌胃针每只鸭每天灌胃2 mL 0.5%羧甲基纤维素钠溶液，高尿酸模型组根据试验鸭平均体重，分别称取表2中相应剂量的腺嘌呤与乙胺丁醇溶入0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，连续灌胃4 d[10]。试验菌株通过拌料给饲，鸭自由采食和饮水。每日观察鸭精神情况，记录发病和死亡情况。试验鸭分别于试验第0、4 d给药前采血，分离血清，测定血清尿酸浓度。1.6数据统计与分析采用SPSS 13软件处理数据，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1产尿酸氧化酶菌株的筛选结果（见图1）由图1可知，在产尿酸氧化酶筛选培养基上，阳性菌株周围形成了明显透明圈，阴性菌株则未形成透明圈。试验共筛选出产尿酸氧化酶菌株56株，其中有13株菌株H/C值大于4.0，H/C值最高为（7.75±0.25）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.F001图1产尿酸氧化酶菌株的筛选结果2.2菌株产蛋白酶、淀粉酶能力的测定结果（见图2）由图2（a）、2（b）可知，在酪蛋白平板上有1株可产生透明圈，其产蛋白酶能力的H/C值为（2.08±0.11）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.F002图2菌株产蛋白酶和淀粉酶能力测定结果由图2（c）、2（d）可知，在淀粉水解培养基上有7株菌株产生透明圈，其产淀粉酶能力的最大H/C值为（4.00±0.72）。2.3菌落形态及革兰氏染色镜检结果对56株菌株进行形态学观察及镜检，通过形态学观察可将56株菌株分为7大类。筛选菌株菌落形态见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.T003表3筛选菌株菌落形态编号颜色形态AS1、a2、a3、a4、a5、a6、a8、a9、a10、a11、a13、a14、a15、a16、d4、d5淡红色圆形，边缘整齐、无皱褶d3、d6、d7、d8、d9、d25淡黄色圆形，皱褶较大，边缘不整齐d15、d18、d23、d36、d42、d49、d50、d55乳白色圆形，边缘整齐、无皱褶d21、d24、d48、C20乳白色椭圆形，边缘不整齐，皱褶较小d16、d33、d34、d35、d37、d38、d39、d40淡黄色圆形，边缘整齐，无皱褶d17、d19、d20、d41、d43、d47、d51、d54、P56淡白色圆形，边缘整齐，无皱褶d22、d28、d29、C4、C7淡黄色椭圆形，边缘不整齐，皱褶较小由表3可知，多数菌落呈规则的圆形，有些为椭圆形；多数菌落边缘整齐、无皱褶，个别菌落边缘不整齐、皱褶较大。革兰氏染色结果显示，51株为革兰氏阴性菌，呈球状或杆状；6株为革兰氏阳性菌，呈杆状或球状。2.416S rDNA测序鉴定结果候选菌株16S rDNA PCR扩增产物克隆测序，经测序所得的基因序列在NCBI数据库上进行序列对比。结果表明，15株为产碱杆菌，4株葡萄球菌、4株大肠杆菌、2株副球菌、1株假单胞菌以及1株乳球菌。菌株AS1和P56的系统发育树见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.F003图3菌株AS1和P56的系统发育树由图3可知，菌株AS1与粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）处于同一分支，菌株P56和瓜里科州假单胞菌（Pseudomonas guariconensis）处于同一分支。根据菌株生长情况、产尿酸氧化酶能力、菌株属性等综合评估，选择产碱杆菌AS1和假单胞菌P56作为候选菌株进行下一步试验。2.5候选菌株AS1、P56对樱桃谷鸭生长性能的影响（见表4）试验期间，AS1组和P56组试验鸭精神状态正常，未见发病或死亡情况，粪便颜色未见异常。由表4可知，CON组、AS1组和P56组鸭的体重、采食量差异均不显著（P0.05）。结果表明，试验菌株对鸭的正常生长无显著影响，可进行下一步研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.T004表4候选菌株AS1、P56对樱桃谷鸭生长性能的影响组别初重/(g/只)末重/(g/只)平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比CON组798±601 068±8767.50±9.02118.34±22.341.75±0.24AS1组785±611 053±6966.88±7.61115.34±18.631.72±0.21P56组778±511 056±3769.69±8.50120.31±16.411.73±0.202.6候选菌株AS1、P56对樱桃谷鸭血清尿酸水平的影响（见图4）由图4可知，在0 d时，各组间樱桃谷鸭血清尿酸水平差异不显著（P0.05）。在4 d时，AS1组、P56组樱桃谷鸭血清尿酸水平与对照组相比差异不显著（P0.05），AE组樱桃谷鸭血清尿酸水平极显著高于对照组（P0.01），AE-P56组与AE组血清尿酸水平差异不显著（P0.05），AE-AS1组血清尿酸水平显著低于AE组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.013.F004图4候选菌株AS1、P56对樱桃谷鸭血清尿酸水平的影响注：不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。结果表明，单独饲喂AS1和P56菌株对樱桃谷鸭血清尿酸水平无显著影响；高尿酸血症（AE组）同时拌料给饲AS1菌株（AE-AS1组），可显著降低血清尿酸浓度，表明AS1可作为缓解鸭高尿酸血症的候选菌株。3讨论3.1尿酸氧化酶候选菌株的筛选目前已知的尿酸氧化酶多数来自微生物，如产阮假丝酵母、芽孢杆菌属、曲霉、微杆菌以及节枝杆菌等[11]。很多研究者开展了对产尿酸氧化酶微生物的筛选研究，但微生物种类较多，且微生物的种类因地理环境不同导致差异较大，因此，筛选出的产尿酸氧化酶微生物差异也较大。潘冬雷等[12]从海洋水域筛选出1株降尿酸的微生物血红短杆菌，发现其尿酸氧化酶活性达到0.07 U/mL。也有研究从海洋水域和人体肠道中分别筛选出两株高产尿酸氧化酶的菌株，分别为苛求芽孢杆菌和彭氏变形杆菌[13-14]。本研究采集不同品种的鸭粪便样，通过尿酸筛选培养基初步筛选出56株产尿酸氧化酶菌株，发现大部分为产碱杆菌。产碱杆菌为短杆状革兰氏阴性菌，与贺海燕等[15]的研究报道一致。目前关于产碱杆菌的研究较少，且主要集中在粪污处理及除臭的相关应用方面[16-17]。Gutierrez-Falcon等[18]研究表明，粪产碱杆菌可有效缓解小鼠的腹膜炎，且粪便中的大肠杆菌减少。因此，本研究可为产碱杆菌在产尿酸氧化酶方面的研究提供参考，并为产碱杆菌在禽类高尿酸血症中的预防和治疗提供新的策略。3.2尿酸氧化酶降尿酸的效果分析本研究从鸭粪便中分离出的新型菌株，在体外具备较强的降解尿酸能力。本试验先确认候选菌株对鸭体重和采食量的影响较小，进而继续探究候选菌株在鸭高尿酸血症中的应用效果。结果显示，菌株AS1具有降低高尿酸血症鸭血清水平的趋势，菌株P56则不具备这样的潜力。有研究表明，饲喂益生菌可降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，可有效缓解和治疗高尿酸血症[19]。本试验结果显示，菌株AS1治疗高尿酸血症组鸭的精神状态明显优于高尿酸血症组，但仍未恢复至正常状态；菌株AS1显著降低高尿酸血症鸭血清尿酸水平，但仍未降低至正常水平。而两株菌株对正常鸭的血清尿酸水平影响均较小，原因可能是添加两株菌株后，机体为维持一定的血清尿酸水平，故而增加尿酸的生成；也可能是菌株AS1在肠道定植后，肠道尿酸被原有的肠道菌群分解[20]，自身调节达到动态平衡状态，具体原因还有待进一步研究。4结论本试验从鸭粪便中分离出56株产尿酸氧化酶菌株，15株为产碱杆菌属；候选菌株AS1、P56分别为产碱杆菌和瓜里科假单胞菌。拌料饲喂候选菌株对鸭的日采食、体重无显著影响；AS1可显著降低高尿酸血症鸭的血清尿酸水平，可用于后续鸭高尿酸血症的研究。