达乌里胡枝子（Lespedeza davurica）是一种优质乡土牧草，广泛存在于我国华北地区，其根系发达，对维持土壤水分、促进整个生态系统恢复具有重要作用[1-3]。研究发现，达乌里胡枝子在轮牧条件下数量性状比较稳定，其叶片内的粗蛋白、可溶性糖和中性洗涤纤维（NDF）含量均在一个较高水平[4]。使用近红外光谱分析白羊草（Bothriochloa ischaemum）和达乌里胡枝子的营养成分发现，达乌里胡枝子营养成分及红外模型预测效果整体高于白羊草[5]。黄土高原地处干旱半干旱地区，而达乌里胡枝子又是黄土高原的优势牧草种，因此采用人为手段增强达乌里胡枝子抗旱能力可更好地提高产量和营养品质[6-7]。近年来，褪黑素在提高植物抗逆性方面的作用备受关注。有研究发现，褪黑素处理可提高植物的抗氧化能力，以此应对不利的环境条件[8-9]。研究发现，外施100 µmol/L的褪黑素可提高芥菜（Brassica juncea）的不定根活力，增加不定根数量[10-11]。Ahammed等[12]研究发现，200 µmol/L的外源褪黑素可有效缓解干旱胁迫对烟草（Nicotiana tabacum）幼苗叶片活力的损伤。在干旱胁迫条件下，褪黑素在提高黄瓜（Cucumis sativus L.）种子萌发率和根的生长速度方面均表现出了较好的效果[13]。本试验以山西农业大学自主培育的‘晋农1号’达乌里胡枝子为试验材料，在叶面喷施25、50、100、200、400 µmol/L褪黑素，分析其膜脂过氧化程度及酶促抗氧化系统的活性，研究褪黑素在干旱胁迫下达乌里胡枝子幼苗生长期的缓解效应，为外源褪黑素在达乌里胡枝子生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料达乌里胡枝子选用‘晋农1号’品种，种子由山西农业大学草业学院提供，选择饱满均匀的种子进行试验。褪黑素（MT）（分析纯）由南京都莱公司提供。1.2试验设计试验共设置7个处理，每个处理4个重复。试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.T001表1试验设计组别处理WMT0正常供水、不添加MTDMT0干旱胁迫、不添加MTDMT1干旱胁迫+25 μmol/L MTDMT2干旱胁迫+50 μmol/L MTDMT3干旱胁迫+100 μmol/L MTDMT4干旱胁迫+200 μmol/L MTDMT5干旱胁迫+400 μmol/L MT试验于2020年6月开始，在山西农业大学动物科技试验站草业学院日光温室（温度25~30 ℃，湿度50%~60%）中采用土壤栽培的方式培养植物。土壤栽培选用的塑料花盆规格为25 cm×21.5 cm×16.5 cm（上径×下径×高），每盆装基质3.0 kg。选取饱满且均匀的达乌里胡枝子种子，使用10%的次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水冲洗干净，均匀地撒在花盆中，每盆播种30颗种子。在达乌里胡枝子种植过程中，为保证受光均匀，每3 d浇一次水，每5 d换一次花盆的方向。生长至第15 d后定苗，每盆留下植株生长一致、均匀分布的植株15株。在培养至第30 d后开始喷施褪黑素（含适量吐温-20用于增强叶片对褪黑素的吸收能力[14]），连续3 d在傍晚喷施，正常浇水组和仅干旱处理组分别喷施等量的蒸馏水。正常浇水组保持土壤含水量为80%，其他处理组通过自然干旱法进行干旱处理，胁迫至第0、5、10、15 d取样，取样时各土壤含水量分别为100%、73.26%、52.86%、38.45%。1.3测定指标及方法1.3.1生长指标株高采用钢尺测定地面至主茎叶尖的垂直高度；选取健康、完全生长的活体叶片，使用手持式叶面积仪测定叶面积，使用游标卡尺测定据地土壤表面2 cm处的茎粗，使用万森根系扫描仪测定地下部生长指标[15]。1.3.2细胞膜通透性膜脂过氧化：H2O2含量使用过氧化氢试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定，相对电导率（EL）使用电导率仪测定[16]；丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法测定[17]；超氧阴离子（O2-）产生速率参考羟胺方法[18]测定。1.3.3非酶促抗氧化系统与酶促抗氧化系统指标抗坏血酸（AsA）采用二联吡啶法，类胡萝卜素（CAR）参考李玲等[17]的方法进行测定；还原性谷胱甘肽（GSH）采用DTNB循环检测法[18]测定。超氧化物歧化酶（SOD）采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定，过氧化物酶（POD）采用愈创木酚法测定，过氧化氢酶（CAT）采用紫外吸收法[17]，抗坏血酸过氧化物酶（APX）采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2013软件进行整理，Origin 2022软件进行绘图，SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子生长情况的影响（见表2）由表2可知，与WMT0组相比，DMT0组的达乌里胡枝子生长受到明显抑制，株高、茎粗和叶面积显著降低（P0.05）。经过施加不同浓度的褪黑素使干旱胁迫下的达乌里胡枝子的株高、茎粗和叶面积较DMT0有不同程度的提升，其中DMT3组的效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.T002表2褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子生长情况的影响组别株高/cm茎粗/mm叶面积/cm2WMT027.05±0.35a1.39±0.10a4.87±0.15aDMT021.06±1.32c0.90±0.09b4.20±0.11cDMT121.19±0.96bc0.91±0.12b4.33±0.13bcDMT223.81±0.65abc1.01±0.08b4.54±0.07abcDMT324.62±0.70ab1.13±0.05ab4.65±0.11abDMT422.90±0.62bc0.91±0.09b4.42±0.11abcDMT520.45±1.64c0.86±0.07b4.29±0.15bc注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。研究表明，干旱胁迫造成了达乌里胡枝子的株高、茎粗和叶面积降低、生长受阻，但施加一定浓度的褪黑素可缓解干旱胁迫对达乌里胡枝子幼苗生长的抑制作用，其中以DMT3处理的效果较好，与正常供水处理组无显著差异（P0.05）。2.2褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子地下部分生长情况的影响（见表3）由表3可知，干旱胁迫会对达乌里胡枝子根系生长产生抑制现象。与WMT0组相比，DMT0组达乌里胡枝子的根长、根系体积和根尖数均显著下降（P0.05），根瘤数虽无显著性差异但数量也有所降低；干旱胁迫下的达乌里胡枝子经过适量浓度的褪黑素处理后各指标总体上均有不同程度的提高，其中以DMT3处理效果最好。研究表明，叶面喷施褪黑素能缓解干旱胁迫对达乌里胡枝子根系的伤害，以DMT3处理的效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.T003表3褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子地下部分生长情况的影响组别根长/mm根系体积/cm3根尖数根瘤数WMT0277.09±21.42a0.76±0.04a513.25±26.29a16.25±2.32aDMT0191.36±9.10bc0.30±0.03c305.75±25.63b12.00±2.30abDMT1190.94±12.02bc0.45±0.08bc328.50±38.88b10.75±2.01abDMT2215.02±10.66bc0.36±0.07c385.00±33.09ab8.25±0.64bDMT3238.63±11.76ab0.49±0.12b391.25±27.48ab13.50±1.85abDMT4214.26±18.63bc0.31±0.05c388.00±26.60ab13.50±1.11abDMT5187.72±6.24c0.27±0.01c251.50±81.92b10.25±1.89ab2.3褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子细胞膜透性的影响（见图1）细胞膜透性以及MDA、H2O2和O2-等可评价植物在胁迫中的受损程度。由图1可知，O2-产生速率、H2O2含量、细胞膜透性以及MDA含量均随着干旱时间增加呈上升趋势并在第15 d时达到最大值。随着胁迫时间增加，褪黑素的缓解效应越明显，在胁迫至第15 d时，DMT3组的叶片细胞膜透性、MDA、H2O2和O2-等物质含量显著低于DMT0组（P0.05）。研究表明，叶面喷施褪黑素可缓解达乌里胡枝子幼苗叶片膜脂过氧化程度，其中以DMT3组的效果较好。图1褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子细胞膜透性的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F1a1（a）O2-产生速率 （b） H2O2含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F1a2（c）叶片细胞膜透性 （d） MDA含量2.4褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子非酶促抗氧化系统的影响（见图2）非酶促抗氧化系统主要包括AsA、GSH、CAR和一些酚类物质构成，可清除自由基，降低膜脂过氧化程度。由图2可知，在持续的干旱胁迫下，AsA和GSH的含量均呈下降趋势，CAR呈先升后降的趋势。胁迫至第5、10 d时，DMT3组缓解干旱胁迫对达乌里胡枝子非酶促抗氧化系统的影响优于其他组；胁迫至第15 d时，DMT3组缓解干旱胁迫对达乌里胡枝子非酶促抗氧化系统的影响与其他处理差异较小。研究表明，DMT3处理能够更好地激活植物叶片的非酶促抗氧化系统，提高植物抵御干旱胁迫的能力。图2褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子非酶促抗氧化系统的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F2a1（a）AsA含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F2a2（b）CAR含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F2a3（c）GSH含量2.5褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子酶促抗氧化系统的影响（见图3）酶促抗氧化系统主要由SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶组成，在干旱胁迫下调节体内活性氧平衡，消除膜脂过氧化发挥重要作用。由图3可知，在持续的干旱胁迫下，达乌里胡枝子叶片的SOD、POD和CAT活性均呈先上升后降低的趋势，APX活性呈下降趋势。当胁迫至第5、10 d时，与其他组相比，DMT1、DMT2、DMT3组提高达乌里胡枝子SOD、POD、CAT和APX活性的效果较好。在胁迫至第15 d时，仅DMT3组提高达乌里胡枝子SOD、POD、CAT和APX活性的效果优于其他组。研究表明，外施褪黑素会在一定程度上提高达乌里胡枝子抗氧化酶的活性，且DMT3的处理效果优于其他组。图3褪黑素对干旱处理下达乌里胡枝子酶促抗氧化系统的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F3a1（a）SOD活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F3a2（b）POD活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F3a3（c）CAT活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.013.F3a4（d）APX活性3讨论3.1褪黑素对植物生长的影响植物遭受干旱胁迫时，可从植物的生长情况判断受胁迫程度。一般情况下，干旱胁迫使植株水分吸收能力降低，导致植物地上部分生长缓慢[19]。本研究发现，干旱（DMT0）处理后的达乌里胡枝子的株高、茎粗和叶面积较对照（WMT0）均显著下降，表明达乌里胡枝子因干旱缺水导致植物生长受阻，与Xu等[20]在水稻（Oryza sativa）上的研究相似。有研究表明，在干旱胁迫下，通过施用一定浓度外源褪黑素可缓解干旱对植物的株高、茎粗和叶面积造成的影响[21]。本研究发现，外源施加100 μmol/L的褪黑素（DMT3）在干旱胁迫环境下效果最好，研究结果与西北农林科技大学在紫花苜蓿上的研究一致[22]。干旱会直接影响植物地下部分的生长，而根系是最先感知土壤环境干旱的部位。本研究中，达乌里胡枝子的根长、根系体积、根尖数和根瘤数在干旱胁迫处理下均显著下降，100 μmol/L浓度的褪黑素（DMT3）效果较好。结果表明，施加褪黑素后可对达乌里胡枝子的根长、根系体积、根尖数和根瘤数产生一定的促进效果，其中只有根系体积与DMT0存在显著差异，总体影响较小。该现象的主要原因可能是叶面喷施直接作用于地上部生长，而地下部必须通过极性运输才能获取褪黑素，从而对地下部影响较小。而根瘤数均无显著增加表明褪黑素可能未参与根瘤菌与豆科植物互生机制。3.2褪黑素对活性氧（ROS）代谢的影响细胞膜在维持细胞代谢稳定中发挥重要作用，但也是最易遭受干旱胁迫伤害的部位之一。植物体内ROS的产生部位主要是叶绿体和线粒体，其作为植物一种最早对水分胁迫防御的生化反应，在植物体内具有重要的作用[23]。植物遭受胁迫后，其碳同化能力下降，光合电子传递过程受阻，O2在类囊体膜上还原成超氧阴离子等，细胞膜遭受到伤害，细胞透性增大，引起膜脂过氧化。MDA是膜脂过氧化最终的产物，会造成电解质外渗，进而使植物叶片的相对电导率增大。通常MDA与相对电导率与胁迫程度呈现正相关的趋势[24]。本试验研究发现，达乌里胡枝子在干旱胁迫下ROS含量不断累积，导致ROS平衡打破，破坏了细胞膜结构。在干旱胁迫第15 d时，达乌里胡枝子叶片细胞膜透性以及MDA含量、H2O2含量和O2-产生速率均显著升高，表明达乌里胡枝子受到了干旱胁迫的损伤，破坏了细胞膜的完整性和稳定性。植物主要通过提高酶促抗氧化系统或非酶促抗氧化性系统的代谢，达到消除ROS的目的[25]。酶促抗氧化系统以SOD、POD、CAT和APX等蛋白酶为主，本试验发现，SOD、POD、CAT活性均呈先升高后降低趋势，而APX则呈持续降低趋势，与杨新元[26]在向日葵（Helianthus annuus）试验中的研究结果不一致，原因可能是干旱胁迫程度不同而呈现的差异。并且本试验中，各酶活性达到最大值时间不同，表明在干旱胁迫时不同阶段启动了不同的酶应对胁迫对植物的伤害；在0~10 d时，各酶具有较好的协调性，而15 d后，植物细胞膜严重受阻，各酶活性均显著降低。结果表明，只有在胁迫至一定程度下，各种酶能够共同清除自由基，而超过该阈值，保护酶活性和协调性则会降低。本试验与赫传杰[27]在樟子松（Pinus sylvestris）的结果相似。Chen等[28]发现，在重度干旱时伊犁绢蒿（Seriphidium transiliense）的SOD活性最大，而POD和CAT活性呈先升高后降低的趋势。因此，各种酶即使在相同胁迫条件下，植物不同，协调作用也不同。非酶促抗氧化系统主要由AsA、GSH、CAR和一些酚类物质构成，可清除自由基，降低膜脂过氧化程度[29]。AsA和CAR被称为天然的非酶类抗氧化剂，在保护植物免受活性氧伤害发挥重要作用。抗坏血酸可参与AsA-GSH循环清除H2O2，也可通过抗坏血酸过氧化物酶清除单线态氧，并且消除·OH自由基等[30]。本试验结果显示，在持续的干旱胁迫下，达乌里胡枝子叶片AsA呈持续降低趋势，GSH呈现持续降低趋势，CAR呈现先升高后降低趋势。有研究认为，在干旱胁迫下，大豆苗的AsA-GSH循环活性会持续降低[21]，与本试验结论一致。4结论本试验结果表明，干旱胁迫严重影响了达乌里胡枝子地上部与地下部的生长；胁迫期间，达乌里胡枝子叶片活性氧不断累积，导致细胞膜结构破坏，电解质外渗，引起膜脂过氧化不断加剧。施加外源褪黑素后显著降低了达乌里胡枝子幼苗叶片的O2-产生速率、H2O2含量、MDA含量以及细胞膜透性，提高了SOD、POD、CAT和APX等酶构成的酶促抗氧化系统活性，增加了AsA、GSH和CAR等非酶促抗氧化系统物质的含量，缓解干旱胁迫造成的细胞膜过氧化损伤，提高了达乌里胡枝子的抗氧化能力，减轻干旱胁迫对达乌里胡枝子叶片细胞膜结构的伤害，其中施加浓度为100 μmol/L的褪黑素效果最佳。