微量元素是人类和动物生命活动所必需的营养物质，在动物生长发育、物质交换、能量代谢和免疫功能中起重要作用[1]。微量元素添加剂最初是微量元素的无机盐，后来逐渐被微量元素的有机酸盐取代。但有机酸盐易离解，导致产品性能不稳定[2]。以氨基酸或短肽与微量元素通过化学方法制成的有机微量元素螯合物具有化学性质稳定、动物小肠易吸收、生物学效价高等特点，因而在畜禽饲料行业的应用越来越广泛。目前，有机微量元素螯合物的主要生产和获取方法包括化学合成和生物转化[3]。自然界中微生物的种类繁多、体积小、表面积大、生命代谢活动旺盛，与微量元素亲和力强，生物聚合物中金属元素可螯合的特点。因此，筛选出能富集微量元素的有益微生物生产有机微量元素，进而开发出集细菌和微量元素于一体的饲料添加剂，成为国内外学者研究的热点。本研究以实验室分离保藏的丁酸梭菌JBH-1株[4]为样本，研究其对锌的富集能力，为微生物有机锌制剂的开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种丁酸梭菌JBH-1株菌株由河南省饲用微生态制剂研究中心从健康仔猪肠道中分离筛选。1.1.2培养基强化梭菌培养基：酵母粉3 g、牛肉粉10 g、葡萄糖5 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、可溶性淀粉1 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、无水乙酸钠3 g、琼脂0.5 g、双蒸水1 000 mL，pH值（6.8±0.1），若为固体培养基则加入18 g琼脂，121 ℃湿热灭菌15 min。基础发酵培养基：葡萄糖20 g、硫酸铵1 g、胰蛋白胨15 g、氯化钠5 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g、无水乙酸钠3 g、双蒸水1 000 mL，pH值（6.8±0.1），121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。1.1.3试验仪器H1850R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），YXQ-LB-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯仪器有限公司），BSD-WX2350卧式智能双层恒温摇床（上海博讯仪器有限公司），YQX-Ⅱ恒温厌氧培养箱（上海恒字医疗器械有限公司），BLBIO-10SJ 10 L生物反应器（江苏百伦生物科技有限公司），TAS-990原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。1.2试验方法1.2.1丁酸梭菌JBH-1株最大耐锌质量浓度测定配制锌含量分别为0、100、200、300、400、500、600 mg/L的梭菌强化液体培养基，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，待培养基冷却后，取50~100 μL甘油管保存的丁酸梭菌JBH-1株接种到上述培养基中，37 ℃厌氧培养箱中培养16~18 h，取出平板观察丁酸梭菌JBH-1株生长情况。1.2.2丁酸梭菌JBH-1株锌富集单因素试验设计单因素试验采用基础发酵培养基在250 mL三角瓶中进行，培养基装液量100 mL，以干菌体产量和锌富集率为指标，对锌离子质量浓度、加锌时间、JBH-1株接种量、培养时间，碳源种类、有机/无机氮源种类共7个因素进行优化。1.2.2.1锌离子质量浓度依据1.2.1中得出的JBH-1株最大耐锌质量浓度为400 mg/L，共设置9个锌离子质量浓度，分别为0、50，100、150、200、250、300、350、400 mg/L，在开始培养时，加入对应锌离子溶液，每个处理组3个重复，接种比例为5%，37 ℃厌氧静止培养16~18 h。1.2.2.2加锌时间共设置7个加锌时间，分别为培养开始0、2、4、6、8、10、12 h，每处理3个重复，锌离子质量浓度200 mg/L，接种比例为5%，37 ℃厌氧静止培养16~18 h。1.2.2.3接种量共设置5个接种量，按接种比例分别为1%、5%、10%、15%、20%，每个处理3个重复，锌离子质量浓度为200 mg/L，加锌时间为开始培养后第6 h，37 ℃厌氧静止培养16~18 h。1.2.2.4培养时间共设置4个培养时间，分别为12、18、24、30 h，每个处理3个重复，37 ℃厌氧静止培养16~18 h。1.2.2.5碳源替代试验按照碳源等质量的原则，分别用麦芽糖、麦芽糊精、乳糖、蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉替代基础发酵培养基中的葡萄糖碳源，每个处理重复3次，于37 ℃厌氧静态培养16~18 h。1.2.2.6有机氮源替代试验按照氮源等量原则，分别用蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、牛肉膏代替基础培养基中的有机氮源胰蛋白胨，每处理3个重复，37 ℃厌氧静止培养16~18 h。1.2.2.7无机氮源替代试验按照氮源等量原则，分别用柠檬酸铵、氯化铵、硝酸铵和氨水替换基础培养基中的无机氮源硫酸铵，每处理3个重复，37 ℃厌氧静止培养16~18 h。1.2.3JBH-1株锌富集正交试验设计在1.2.2的基础上，对锌离子质量浓度（A）、加锌时间（B）、JBH-1株接种量（C）、培养时间（D）、蔗糖添加量（E）、酵母浸粉添加量（F）、氯化铵添加量（G）进行L18(37)正交试验。正交试验因素与水平设计见表1。每处理3个重复，以锌富集率为指标，确定丁酸梭菌JBH-1株菌株的最优富锌发酵条件组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.T001表1JBH-1株锌富集正交试验的因素与水平水平A/(mg/L)B/hC/%D/hE/(g/L)F/(g/L)G/(g/L)1150451215101220081018201523250121524252031.2.4JBH-1株在最优条件下的发酵试验以得到的最佳优化条件进行50 L生物反应器厌氧发酵试验，装液量为35 L。1.2.4.1单位菌体产量将培养结束后的菌液7 000 r/min离心10 min，弃上清液，使用pH值7.2的PBS反复洗涤5次，将得到的菌体在80 ℃烘干箱中烘干至恒定质量，即为干菌体质量，干菌体质量和菌液体积之比，即为单位菌体产量。1.2.4.2锌富集率参照文献[5]中的方法，将干菌体在高温电阻炉（550±15）℃下灰化，之后残留物用6 mol/L盐酸溶解并稀释至标定刻度，引入原子吸收分光光度计的空气-乙炔火焰中以测定稀释剂中的锌含量，并换算稀释液中的锌总含量。稀释液中锌总含量即为干菌体中锌的总含量。干菌体中锌总含量和培养液中锌的总添加量比值即为锌富集率。1.2.4.3锌有机化率测定参照文献[6]至文献[7]中的方法，定量称取JBH-1株干菌体，加至10 mL双蒸水中，涡旋振荡混匀，超声粉碎8 min，过D101大孔吸附树脂，采用体积分数为1%的HNO3洗涤树脂，收集洗涤液，使用原子吸收分光光度计测定洗涤液中的锌含量，即无机锌量。有机锌的量为干菌体锌总含量减去无机锌量后的值。锌的有机化率是干菌体中有机锌含量与总锌含量的比值。2结果与分析2.1JBH-1株在不同锌离子质量浓度培养基中生长情况（见图1）由图1可知，JBH-1株在0~400 mg/L锌离子的梭菌强化液体培养基中均能够正常生长，而在500、600 mg/L质量浓度下无法正常生长。因此JBH-1株最大耐锌离子质量浓度为400 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F001图1JBH-1株在不同锌离子质量浓度培养基中生长情况2.2JBH-1株锌富集单因素试验结果2.2.1锌离子质量浓度对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图2）由图2可知，随着液体培养基中锌离子质量浓度的增加，JBH-1株锌富集率和菌体产量呈现先升高后降低的趋势。当锌离子质量浓度为0~200 mg/L时，锌富集率和干菌体产量均增加，在锌离子质量浓度为200 mg/L时达到最大值；当锌离子质量浓度超过200 mg/L时，锌富集率和菌体产量均呈下降趋势。因此，当培养基中锌离子质量浓度为200 mg/L时JBH-1株对锌富集率和菌体产量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F002图2锌离子浓度对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。2.2.2加锌时间对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图3）由图3可知，随着加锌时间推迟，JBH-1株锌富集率在0~4 h呈上升趋势，在培养4 h时加锌，锌富集率和菌体产量均达到最大值；超过4 h加锌，锌富集率和菌体产量均呈下降趋势。因此，在培养4 h时加锌，JBH-1株对锌富集率和菌体产量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F003图3加锌时间对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响2.2.3接种量对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图4）由图4可知，随着JBH-1株接种量依次增加，锌富集率和干菌体产量均呈上升趋势。当JBH-1株接种量为10%时，锌的富集率和干菌体产量均达到最大值；此后随着JBH-1株接种量增加，锌富集率和干菌体产量增加不显著（P0.05）。因此，接种量为10%时，JBH-1株具有最高的锌富集率和干菌体产量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F004图4接种量对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响2.2.4培养时间对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图5）由图5可知，随着培养时间增加，JBH-1株锌富集率和菌体产量呈上升趋势，在18 h时均达到最大值；此后随着培养时间增加，锌富集率和菌体产量增加不显著（P0.05）。因此，培养时间为18 h时，JBH-1株对锌富集率和菌体产量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F005图5培养时间对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响2.2.5碳源种类对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图6）由图6可知，JBH-1株在碳源为蔗糖时，锌富集率和菌体产量最高，显著优于其他碳源（P0.05）。JBH-1株对其他碳源的利用效率排序为乳糖糖蜜麦芽糖麦芽糊精可溶性淀粉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F006图6碳源种类对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响2.2.6有机氮源种类对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图7）由图7可知，JBH-1株在有机氮源为酵母浸粉时，锌富集率和菌体产量最高，显著优于其他有机氮源（P0.05）。JBH-1株对其他有机氮源的利用效率排序为牛肉膏牛肉粉蛋白胨。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F007图7有机氮源种类对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响2.2.7无机氮源种类对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响（见图8）由图8可知，JBH-1株在有机氮源为氯化铵时，锌富集率和菌体产量最高，显著优于其他无机氮源（P0.05）。JBH-1株对其他无机氮源的利用效率排序为硝酸铵柠檬酸铵氨水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.F008图8无机氮源种类对JBH-1株锌富集和菌体生长的影响2.3JBH-1株锌富集条件的正交试验结果分析（见表2、表3）由表2可知，根据R值判断7种因素对JBH-1株锌富集率影响排序为BGDEFAC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.T002表2JBH-1株锌富集率正交试验结果分析项目ABCDEFG锌富集率/%菌体产量/(g/L)1223121163.121.022111111162.130.983313133271.461.134132323172.301.265333213172.111.186131231275.401.427221213369.151.088321332171.281.119123312267.461.0210232112272.351.1811113222371.121.13续表2　JBH-1株锌富集率正交试验结果分析由表3、表4可知，因素B对锌富集率具有显著影响（P0.05），而因素F对菌体产量具有显著影响（P0.05），且7因素最优水平组合为A3B3C2D2E3F3G2，即锌离子质量浓度250 mg/L、加锌时间为开始培养后第12 h、JBH-1株接种量10%、培养时间18 h、蔗糖添加量25 g/L、酵母浸粉添加量20 g/L、氯化铵添加量2 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.T004表3JBH-1株锌富集率正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值误差49.000316.333A3.14221.5710.0960.911B21.468210.7341.6570.028C28.299214.1490.8660.505D41.476220.7381.2700.399E24.642212.3210.7540.543F27.666213.8330.8470.511G7.64523.8230.2340.805注：P0.05表示影响显著；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.T005表4JBH-1株菌体产量正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值误差0.03530.012A0.00620.0030.2730.778B0.00720.0040.2990.761C0.01720.0080.720.556D0.05620.0282.3750.241E0.02420.0121.0210.459F0.07320.0623.8210.013G0.00220.0010.0690.934以该最优组合为发酵条件进行发酵模拟评估试验，结果发现，JBH-1株锌富集率为78.50%，菌体产量为1.47 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.017.T003项目ABCDEFG锌富集率/%菌体产量/(g/L)12331122370.461.1513312311365.901.0614122133369.271.0915212232167.421.0716233331372.101.2317322221273.051.2518211323269.101.10K1417.68407.13417.52408.79409.10411.70408.36K2413.24413.33420.29428.25419.15420.09428.82K3424.26434.72417.37418.14426.93423.39418.00k169.6167.8669.5968.1368.1868.6268.06k268.8768.8970.0571.3869.8670.0271.47k370.7172.4569.5669.6971.1670.5769.67R1.844.590.493.252.981.953.41主次顺序BGDEFAC最优组合A3B3C2D2E3F3G22.4JBH-1株最优组合发酵试验结果以2.3中得到的最优组合条件进行发酵试验，结果表明，设置锌离子质量浓度为250 mg/L，锌富集量可达7 087.5 mg，得到干菌体重量50.75 g，单位菌体锌富集量为139.66 mg/g。锌富集率为82.57%。有机锌含量为893.025 mg，锌有机率可达12.60%。3讨论动物体内微量元素锌的含量仅次于铁，含量为10~100 mg/kg，主要分布在骨骼肌中[8]。研究表明，锌参与机体细胞分裂、生长和分化过程中的调控以及蛋白质合成等过程[9]。机体主要是摄入食物获取锌，当机体摄取锌不足时易引起锌缺乏症。锌缺乏症表现为严重生长发育迟缓和造血功能障碍，同时伴随内脏器官肿大、性腺机能减退、免疫低下等系列症状，孕妇患锌缺乏症时还会导致胚胎发育异常、新生儿畸形等病症[10]。目前，可通过食补合并药补方式补充锌[11]。因此，除常规锌制剂相关食品外，开发高效有机锌制剂得到了广泛关注。微生物因其在自然界中数目庞大，种类繁多，繁殖迅速且周期短的特点，被广泛关注用于富集微量元素并转化为有机元素形式应用于工业生产和医疗行业中。目前，富集锌元素的研究多为乳酸菌和酵母菌[12-15]，但关于丁酸梭菌富集锌鲜有报道，而丁酸梭菌同样具有富集金属离子的功效。此外，与乳酸菌相比，丁酸梭菌具有抗逆性好、耐胃酸、耐高温、抑菌，并为肠道提供能量[16-18]，利用丁酸梭菌富集锌可能比用乳酸菌富集锌具有更高的价值。本试验以最优水平组合条件进行50 L发酵罐模拟发酵，结果显示，干菌体重量50.75 g，单位菌体锌富集量为139.66 mg/g，锌富集率为82.57%。张青松[12]报道，植物乳杆菌CCFM242在含锌水溶液中的富锌量为19.84 mg/g。韩欣然[19]报道，长双歧杆菌CCFM1195锌富集量最高可达到84.2 mg/g。上述研究表明，丁酸梭菌对锌富集能力可能更优于乳酸菌。本研究中，JBH-1株在18 h后锌富集率和菌体产量达到最大值，此后随着时间延长，锌富集率和菌体产量增加量不显著，这可能是菌体依托表面的活性基团吸附锌离子，吸收速率随菌体数量增长而增加；随着培养时间延长，表面活性集团性质改变，金属离子脱落，导致富集率不再增加。Sari等[20]发现，适当提高接种量可增加菌体对锌的富集量，但菌体易聚集成团块掩盖部分结合位点，从而降低富集效率，导致单位重量菌体富集量下降。因此，当接种量超过10%时，锌富集率和菌体产量增加量不显著。结合丁酸梭菌JBH-1株锌有机率可达12.60%，该菌可作为锌制剂来源工程储备菌株。但目前仍需提升工艺提高锌有机化率指标，以保证其发挥实际功效。同时，丁酸梭菌富锌的机制及其在动物体的吸收、代谢过程、安全性尚未明确，仍需进一步研究。4结论本研究结果表明，对丁酸梭菌JBH-1株富集锌性能影响因素排序为加锌时间氯化铵添加量培养时间蔗糖添加量酵母浸粉添加量锌离子质量浓度接种量。当锌离子质量浓度250 mg/L、加锌时间为开始培养后第12 h、接种量10%、培养时间18 h、蔗糖添加量25 g/L、酵母浸粉和氯化铵添加量分别为20、2 g/L。发酵罐模拟发酵结果表明，干菌体重量50.75 g，单位菌体锌富集量为139.66 mg/g。锌富集率为82.57%。因此，丁酸梭菌JBH-1株可以作为畜禽用微生物有机锌制剂的储备菌株。