目前宠物犬饲养以笼养为主，但笼养会使犬难以获得足够的户外活动时间，易出现情感障碍。Spangenberg等[1]研究表明，笼养犬精神较萎靡，且血液中中性粒细胞数、白细胞数等炎症相关指标明显高于户外活动的犬。同时，长期的室内圈养使宠物犬无法与同类交流，会出现情绪异常[2]。焦虑、抑郁[3]等情绪产生时会造成体内自由基代谢失衡，甚至进一步造成机体生理性损伤。抗氧化性剂对焦虑和抑郁情绪等具有抑制作用[4-5]。迷迭香提取物是一种饲料中常用的天然抗氧化剂，分为水溶性和脂溶性。水溶性迷迭香提取物的主要有效成分是迷迭香酸，脂溶性迷迭香提取物的主要有效成分是鼠尾草酸和鼠尾草酚[6]。在宠物饲粮中，脂溶性迷迭香提取物应用更为广泛。但目前尚无关于迷迭香提取物对长期笼养造成的宠物情绪异常影响的研究。本研究比较了笼养犬和有遛狗习惯的家庭宠物犬血清氧化应激标志分子含量以及笼养犬饲喂含迷迭香酸的饲粮前后的精神状态、血清抗氧化及免疫相关指标，为迷迭香提取物在改善笼养犬精神状态及生理健康方面的研究应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与主要试剂1.1.1试验材料迷迭香提取物购自湖南先伟阳光生物科技有限公司，鼠尾草酚及鼠尾草酸含量为15%。笼养犬基础饲粮为杭州科盛宠物食品有限公司生产的全价膨化犬粮，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.0玉米38.0粗蛋白32.60鱼粉18.5粗纤维2.67鸡肉粉12.5粗脂肪9.20肉骨粉10.0粗灰分7.90甜菜粕6.5钙1.57酵母培养物4.5总磷3.95鸡油5.0预混料5.0注：1.每千克预混料为饲粮提供：VA 600 000 IU、VD3 100 000 IU、VE 5 000 IU、VK3 200 mg、VB1 1 500 mg、VB2 1 000 mg、VB6 750 mg、VB12 2.5 mg、生物素10 mg、叶酸150 mg、烟酸3 000 mg、泛酸钙2 000 mg、胆碱250 000 mg、Fe 9 600 mg、Cu 2 000 mg、Zn 8 000 mg、Mn 4 500 mg、I 150 mg、Co 30 mg、Se 30 mg；预混料中含鸡肝水解物类诱食剂。2.营养水平均为实测值。%1.1.2主要试剂血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、免疫球蛋白G（IgG）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，血清谷胱甘肽（GSH）试剂盒购自上海琮益科技有限公司，血清二胺合酶（DAO）及8-羟基鸟苷（8-OH-dG）试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。其余试剂均为分析纯，购自上海国药试剂有限公司。1.2试验设计1.2.1散养犬与笼养犬血清氧化应激水平比较试验1.2.1.1试验动物每天遛狗时间大于60 min或居住在有院落家庭的健康犬（不含幼犬及妊娠期、哺乳期犬）为散养犬；平均每天遛狗时间小于5 min，且无院落的健康犬为笼养犬。收集血样时间为2021年6月至2022年10月，其中散养犬血样93例，笼养犬血样149例，品种包括泰迪、中华田园犬、比熊、柯基、金毛、雪瑞纳、柴犬，年龄1~7岁。1.2.1.2血清生化指标散养犬血清为收集3 000 r/min离心10 min，-20 ℃保存，30 d内完成测定。笼养犬血清采集后-20 ℃保存，1 w内测定。采用试剂盒测定SOD、GSH-Px、MDA、8-OH-dG、GSH指标，按照操作说明书进行检测。1.2.2迷迭香提取物补充对笼养犬活动、排便情况及血清生化指标的影响试验1.2.2.1试验动物及饲养管理30只、3~4周岁笼养犬（比格犬）由上海交大农生实验实习场有限公司提供。比格犬成年（12个月）后即用于试验，每只犬单独饲养于1 m × 0.8 m × 0.9 m的饲养笼中，犬可以通过声音交流，但无法看见彼此。试验经上海交通大学实验动物中心动物伦理审查委员会批准，编号220801。试验期8 w，试验前适应性喂养1 w。试验前4 w比格犬饲喂基础饲粮，后4 w在基础饲粮上喷涂300 mg/kg迷迭香提取物。犬舍长期保持（25.0±3.0）℃，每天9：00和16：00各喂食1次，给予充足饲粮及饮水，每日9：00清扫犬舍。试验犬除试验采血等活动由兽医短暂带离外，无出笼活动机会。每天记录试验犬的采食量、异常情况。1.2.2.2活动记录及粪便评分笼养犬在试验期间的活动情况由小佩网络科技（上海）有限公司生产的智能狗项圈记录，该智能项圈能够记录动物每日的剧烈活动、普通活动及睡眠时间。试验期间每天观察比格犬粪便情况，参照赵熠群等[7]方法进行粪便评分，粪便评分见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.T002表2粪便评分粪便情况评分坚硬、干片状或小石头样1成型、干结、但硬软适度2柔软、成型、湿润条状3柔软、不成形4水状、可以倒出51.2.2.3营养物质表观消化率在第4 w和第8 w结束收集试验犬粪便，称重，采用酸不溶灰分法测定养分表观消化率。将收集好粪样在65 ℃烘箱连续烘干48 h，室温静置24 h称重，使用粉碎机粉碎后制成风干样。干物质、粗蛋白、粗脂肪、酸不溶灰分分别依照国标GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 23742—2009测定。营养物质表观消化率=1－(饲料中酸不溶灰分含量/粪样中酸不溶灰分含量)×(粪样中养分含量/饲料中养分含量)×100%(1)1.2.2.4血清生化指标试验犬由执业医师通过前肢静脉采血。IgG、ALT、AST、BUN、CREA、皮质醇（COR）、促肾上腺皮质激素（ACTH）指标均按照试剂盒说明进行操作。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2019进行数据整理与统计分析，独立样本t检验进行显著性分析。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1散养犬和笼养犬血清中氧化应激相关指标（见图1）由图1可知，与散养犬相比，笼养犬血清GSH含量极显著降低（P0.01），血清8-OH-dG含量极显著升高（P0.01），表明长期笼养造成了宠物犬的氧化应激。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.F001图1散养犬和笼养犬血清中氧化应激相关指标注：厢式图最上方和最下方的线段分别表示数据的最大值和最小值，箱图的上方和下方的线段分别表示第3/4分位数和第1/4分位数，箱图中间的线段表示数据的中位数，空心方框表示平均值；P0.01表示差异极显著。2.2迷迭香提取物对笼养犬体重、平均采食量及营养物质表观消化率的影响（见表3）由表3可知，试验前后笼养犬体重、平均日采食量及其对饲粮粗蛋白和粗脂肪的表观消化率差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.T003表3迷迭香提取物补充对笼养犬体重、平均日采食量及营养物质表观消化率的影响项目体重/(kg/只)平均日采食量/[g/(只·d)]粗蛋白表观消化率/%粗脂肪表观消化率/%P值0.1100.9190.0640.174前4 w9.61±0.23311.47±5.3080.29±0.2489.10±0.57后4 w9.72±0.26311.30±5.2281.23±0.5489.64±0.572.3迷迭香提取物对笼养犬睡眠时间及活动时间的影响（见图2）由图2可知，采食含有迷迭香提取物饲粮的笼养犬的睡眠时间略有延长，且剧烈活动时间缩短（P0.05）；采食含有迷迭香提取物的饲粮的笼养犬的一般活动时间延长（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.F002图2迷迭香提取物对笼养犬睡眠时间及活动时间的影响注：P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著；下图同。因犬笼具有空间限制，试验犬剧烈活动一般在饲养员喂食时、人员进出造成的兴奋、紧张等情况下产生，主要表现为在笼具内快速转圈、摇动笼具等，并非跑、跳等传统意义上的剧烈运动。研究表明，补充迷迭香提取物有利于笼养犬睡眠和镇静，对常规活动无影响。2.4迷迭香提取物对笼养犬粪便评分的影响本次研究发现，笼养犬采食不含迷迭香提取物的普通犬粮的平均粪便评分为2.77，采食含迷迭香提取物的普通犬粮的平均粪便评分为2.56。2.5迷迭香提取物对笼养犬血清抗氧化指标的影响（见图3）由图3可知，与未添加迷迭香提取物相比，饲粮中添加迷迭香提取物的笼养犬血清SOD、GSH-Px活性及GSH含量显著提高（P0.05），MDA和8-OH-dG含量显著下降（P0.05）。研究表明，迷迭香提取物补充有助于改善笼养犬抗氧化水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.F003图3迷迭香提取物对笼养犬血清抗氧化指标的影响2.6迷迭香提取物对笼养犬的应激指标的影响（见表4）由表4可知，补充迷迭香提取物笼养犬血清COR含量有所降低（P0.05），ACTH含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.T004表4迷迭香提取物对笼养犬的应激指标的影响项目CORACTHP值0.0700.004前4 w94.74±2.7051.51±2.09后4 w88.92±2.7349.04±1.47ng/L2.7迷迭香提取物对笼养犬常规血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，饲粮中添加迷迭香酸笼养犬血清IgG含量略有上升（P0.05），ALT和AST活性显著下降（P0.05）。研究表明，添加迷迭香提取物对笼养犬的肝脏具有一定保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.025.T005表5迷迭香提取物对笼养犬常规血清生化指标的影响项目IgG/(g/L)ALT/(U/L)AST/(U/L)BUN/(mmol/L)CREA/(μmol/L)P值0.0700.0040.0230.8190.122前4 w14.51±0.5940.42±1.0928.69±1.2427.76±0.9476.36±0.80后4 w15.77±0.5738.45±0.9327.76±0.9427.97±0.7877.67±0.773讨论3.1散养犬和笼养犬血清中氧化应激指标分析饲养方式（情感）会影响宠物犬猫体内自由基代谢平衡[8]。Sechi等[9]利用存在焦虑应激的犬进行试验，发现喂食含有抗氧化性成分的犬肾上腺素和皮质醇血浆浓度显著下降，氧化应激标志物显著减少。Passantino等[10]发现，不同居住环境犬的抗氧化能力具有明显区别。本研究发现，与散养犬相比，笼养犬的抗氧化酶活性下降、氧化产物含量上升，表明笼养犬发生氧化应激。Part等[11]发现，笼养犬和一般家养犬的抗氧化能力无显著差异，其原因可能是笼养环境较好，且样本量较少。3.2迷迭香提取物对宠物犬体重、采食量及营养物质表观消化率的影响迷迭香提取物已列入我国《饲料添加剂品种目录》中[12]。本试验中迷迭香提取物的使用剂量参考了Bampidis等[12]的研究，控制在安全剂量范围内。本研究发现，在饲喂迷迭香提取物期间，笼养比格犬的平均日采食量及体重均未发生显著变化，并且添加300 mg/kg迷迭香提取物未影响犬对饲粮的适口性。本研究结果表明，迷迭香提取物对饲粮粮的主要营养物质消化无显著影响。3.3迷迭香提取物对笼养犬睡眠时间、活动时间、应激状态的影响本研究中，笼养犬采食迷迭香提取物后，睡眠时间略有提升，剧烈活动时间也明显降低。Nematolahi等[13]通过一项随机双盲试验证实了迷迭香补充能够减少焦虑和抑郁，改善睡眠。张婷[14]发现，迷迭香复合精油能够改善脑卒中后的抑郁与焦虑。本研究发现，迷迭香提取物能够存在缓解犬焦虑的作用。迷迭香提取物的抗抑郁、抗焦虑行为与其调节大脑中催产素水平有关[15]。迷迭香提取物中一些成分如齐墩果酸、迷迭香醇等是γ－氨基丁酸（GABA）受体[16]。GABA是中枢神经系统的抑制性传递物质，迷迭香提取物可通过与GABA结合，一方面结合抗焦虑的脑受体并使之激活；另一方面阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢。ACTH和COR均是应激相关的重要激素分子，机体在应对应激时产生[17]。本研究中，300 mg/kg迷迭香提取物可使血清ACTH显著下降，COR也有降低趋势，表明补充迷迭香提取物能够缓解笼养宠物犬的焦虑。3.4迷迭香提取物对笼养犬粪便评分的影响肠道是应激反应的中心器官[18]。许多应激反应均会引起肠道的损伤，如仔猪断奶[19]、蛋鸡热应激[20]、高脂高糖饮食[21]等。肠道的应激损伤容易引起肠黏膜的破坏，一些致病菌会趁机突破肠道屏障进入血液，进而引起动物病理性腹泻[18,22]。一般认为评分2~3是较理想的粪便状态[8]。本试验，采食基础普通犬粮犬的粪便评分为2.77，在喂食迷迭香提取物后，笼养犬粪便评分降至2.56，粪便状态更理想。因此，迷迭香提取物能够一定程度上减少笼养犬粪便水分，这为改善宠物软便问题提供了新思路。3.5迷迭香提取物对笼养犬抗氧化指标的影响迷迭香提取物含多种酚酸及黄酮类物质，其中鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酸是主要的抗氧化成分[6]。在迷迭香乙醇提取物中，鼠尾草酚和鼠尾草酸之和可占提取物总量的50%以上[23]，其中鼠尾草酸是最主要的抗氧化活性成分[24]。Masuda等[25]研究表明，鼠尾草酸含有两个羟基，在与自由基的反应过程中，11位的羟基首先将氢原子传递给自由基，自身则形成两种没有抗氧化性的稳定的新物质，从而中断自由基的链式反应，起到抗氧化作用的效果。Cai等[26]研究表明，迷迭香酸能够激活肠道上皮的Nrf2信号通路，作用于ARE元件，启动机体抗氧化相关分子的表达。本研究中，采食迷迭香提取物的笼养犬，抗氧化指标均有显著改善，与Schlieck等[27]发现饲喂含迷迭香的犬粮的犬氧自由基（ROS）更低，抗氧化酶活力更高的结果相似。3.6迷迭香提取物对笼养犬血清生化指标的影响迷迭香提取物具有增强动物免疫功能[28]。本研究发现，采食迷迭香提取物的笼养犬血清IgG含量有上升趋势。迷迭香提取物具有抗炎症作用[29]。本研究发现，迷迭香提取物对笼养犬肝功能指标有一定改善作用。本研究中，添加迷迭香提取物对宠物犬血清尿素氮及肌酐含量均无影响，表明迷迭香提取物未对笼养犬的肾脏功能产生影响。4结论本研究表明，长时间笼养会造成宠物犬氧化应激，饲粮中补充迷迭香提取物能够提高笼养宠物犬抗氧化能力，延长睡眠时间并显著缩短焦虑时间，改善粪便质量，并具有肝脏保护作用。