广西水牛存栏数量较高[1]，主要以规模化牧场（50头以上）和家庭散养两种养殖模式共存，生水牛乳由奶站集中收购后，冷链运输到加工企业。水牛乳营养价值高，其生鲜乳品质的影响因素有遗传因素、营养调控以及环境因素等[2]。其中关于营养调控对乳制品影响的研究较多，关于运输过程中冷链对乳制品的影响关注甚少。研究发现，低温冷链贮存过程中嗜冷菌会严重影响乳及乳制品的货架期和品质稳定性[3-5]。嗜冷菌可形成生物被膜，为有害微生物生长创造环境条件[6]。宏基因组学直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建文库，依托高通量测序技术（NGS）研究样品全部微生物的遗传组成及其群落功能[7-8]。目前，宏基因组学广泛应用于研究食品中微生物群落组成、物种丰度表达以及新物种发现等方面。马静等[9]基于NGS分析发现，牦牛和犏牛生鲜乳中微生物丰度存在显著差异，从种水平上明确了不同牛乳的异同优势菌。夏亚男等[10]利用NGS技术揭示酸马奶中门、科、属、种微生物多样性，确定优势菌种。Edrissa等[11]阐明冈比亚传统发酵乳“Kosam”中微生物群落组成，确定优势乳酸菌菌株。本研究基于NGS测序技术分析广西地区生水牛乳中嗜冷菌群落组成，进一步探究不同冷藏时间和牧场规模对嗜冷菌多样性的影响，为防控生水牛乳中嗜冷菌提供参考。1材料与方法1.1样品的采集19个生水牛乳奶样（10~20 mL）分别于2022年1—3月采自广西南宁、灵山、横县等5个主要水牛奶产区。其中规模化牧场采集水牛乳奶样14个（50~700头），编号为AM1~AM4和BM5~BM14）；奶站采集水牛乳奶样5个（全部为散户送样，散户养殖规模10~50头），编号为AN1~AN5。根据不同牧场和奶站的实际运行情况，奶样分为冷藏24 h组（9个，AN1~AN5、AM1~AM4）和48 h组（10个，BM5~BM14），用于测序的样本立即干冰运输，送至上海生工生物工程技术服务有限公司检测。1.2样品DNA提取及处理生水牛乳经过离心处理后，采用OMEGA试剂盒E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit提取生水牛乳中全部微生物DNA，1%琼脂糖凝胶检测DNA完整性，Thermo Qubit 4.0荧光定量仪检测DNA样本浓度。利用Qubit™ dsDNA HS Assay Kit对基因组浓度精准定量，确定构建文库所需DNA总量，使用Covaris220将DNA打碎成片段，浓缩回收，纯化后采用Qubit 4.0检测浓度。1.3文库构建和上机测序参照Hieff NGS®高通量测序平台专用的建库试剂盒说明书进行文库构建，将纯化的DNA进行末端修饰，接头连接和磁珠分选纯化连接产物，纯化后产物进行PCR扩增富集，纯化PCR扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，使用Qubit 4.0测定文库浓度，文库合格后使用NovaSeq 6000测序仪对文库进行末端配对测序分析。1.4数据统计与分析为保证信息质量，需对原始数据过滤，去掉含有带接头、低质量序列，得到clean数据；通过去除reads中的接头序列、全局裁剪和划窗质量裁剪、质量过滤、去宿主污染后对测序的原始数据通过Fastp-0.36进行质量评估，数据过滤后，统计分析有效reads。使用Excel和SPSS 28软件对结果进行统计与分析，Alpha多样性分析结果均使用“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。嗜冷菌多样性中群落结构分析柱状图在OriginPro2021中生成，主坐标分析（PCoA）、ANOSIM分析、带聚类树的堆叠柱状图由http://www.cloudtutu.com在线制图。2结果与分析2.1不同冷藏时间对水牛乳Alpha多样性指数的影响（见表1）由表1可知，冷藏48 h水牛乳的Simpson指数和Shannon指数高于冷藏24 h（P0.05）。冷藏48 h水牛乳Chao1指数为2 969 225，高于24 h组，但冷藏48 h水牛乳的Ace指数偏低。冷藏48 h和24 h样本文库的覆盖率均大于90%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.T001表1不同冷藏时间对水牛乳多样性指数的影响项目Simpson指数Shannon指数Chao1指数Ace指数覆盖率/%P值0.0890.0810.6730.8620.08324 h0.997 6±0.001 811.95±0.442 942 825±140 6323 010 508±136 50290.36±2.4848 h0.998 7±0.000 412.27±0.242 969 225±127 7373 000 104±120 66192.11±1.332.2不同冷藏时间对生水牛乳中嗜冷菌多样性的影响2.2.1不同冷藏时间对水牛乳门水平微生物群落结构的影响（见图1）在门水平上，从冷藏24 h和48 h生水牛乳中共检测32个门。由图1可知，生水牛乳主要优势门均为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），总相对丰度＞90%。参照NY/T 1331—2007[12]和国际乳品联合会（IDF）101A:1991[13]标准，通过传统培养方法鉴定嗜冷菌的多个文献进行综合整理[14-19]，获得本研究的参考嗜冷菌范围。将参考嗜冷菌与本次宏基因组测序结果比对，发现生水牛乳中的嗜冷菌共有3个门38个属151个种，3个门分别为变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门（Bacteroidetes）。在冷藏24 h和48 h水牛乳样品中检出变形菌门分别有21个属和24个属，厚壁菌门有10个属和8个属，拟杆菌门均有4个属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F001图1不同冷藏时间对水牛乳门水平微生物群落结构的影响2.2.2不同冷藏时间对生水牛乳属水平微生物群落结构的影响（见图2、图3）由图2可知，在属水平上，水牛乳嗜冷菌群的优势菌属包括假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、莫拉菌属（Moraxella）、肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）。不同冷藏时间生水牛乳的优势嗜冷菌相同，在冷藏24和48 h，不动杆菌属（25.1% VS 21.8%）、链球菌属（22.2% VS 18.0%）、乳球菌属（12.4% VS 6.9%）、莫拉菌属（10.4% VS 2.9%）和假单胞菌属（13.5% VS 38.2%）、金黄杆菌属（5.4% VS 9.3%）的相对丰度存在差异。而肠杆菌属（4.5% VS 0.2%）和芽孢杆菌属（3.9% VS 0.7%）在贮藏48 h后不再成为优势菌属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F002图2不同冷藏时间对生水牛乳属水平微生物群落结构的影响由图3可知，大多数冷藏24 h（8个）和48 h（5个）的生水牛乳样品聚集在一起，相似度较高，并通过ANOSIM分析组间差异不显著（R=0.108，P0.05），表明冷藏24 h和48 h水牛乳样品的嗜冷菌群落结构相似。冷藏24 h中AM4远离组内其他8个样品，冷藏48 h水牛乳样品BM10~BM14也不在重叠区域内，彼此间距较为分散，与48 h组内其他样品的嗜冷菌群落结构有所不同。研究表明，虽然不同冷藏时间嗜冷菌属水平菌群结构组间有相似之处，但同时存在组内个体差异，这种个体差异可能与养殖模式和牧场管理水平等有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F003图3不同冷藏时间对生水牛乳嗜冷菌群落结构的PCoA分析2.2.3不同冷藏时间对生水牛乳种水平微生物群落结构的影响（见图4、图5）由图4可知，在种水平上，嗜冷菌群的主要优势菌种包括鲍曼不动杆菌（Acinetobacter_baumannii）、猪链球菌（Streptococcus_suis）、奥斯陆莫拉氏菌（Moraxella_osloensis）、Chryseobacterium_haifense、荧光假单胞菌（Pseudomonas_fluorescens）、格氏乳球菌（Lactococcus_garvieae）等。不同冷藏时间水牛乳的优势嗜冷菌相同，但水牛乳相对丰度存在差异的菌共有8种，分别是鲍曼不动杆菌（22.8% VS 18.1%）、猪链球菌（22.1% VS 18.0%）、奥斯陆莫拉氏菌（10.4% VS 2.9%）、格氏乳球菌（7.0% VS 3.0%）、韩国假单胞菌（Pseudomonas_koreensis，3.3% VS 1.9%）、约翰不动杆菌（Acinetobacter_johnsonii，1.7% VS 1.4%）、Chryseobacterium_haifense（4.3% VS 8.8%）、荧光假单胞菌（4.4% VS 8.7%）。其中在24 h水牛乳样品中为优势菌，但48 h后不再成为优势菌的包括Enterobacter_cloacae（4.4% VS 0.2%）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus_cereus，3.9% VS 0.7%）；而在24 h样本中为非优势菌，但48 h后成为优势菌的包括霉实假单胞菌（Pseudomonas_fragi，0.2% VS 5.8%）、嗜冷假单胞菌（Pseudomonas_psychrophila，0.1% VS 5.2%）、隆德假单胞菌（Pseudomonas_lundensis，0.3% VS 4.5%）、浅绿色假单胞菌（Pseudomonas_lurida，0.9% VS 2.4%）等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F004图4不同冷藏时间对水牛乳种水平嗜冷菌群落结构的影响由图5可知，PCOA1和PCOA2的贡献率分别是38.78%和22.12%，并且大多数冷藏24 h（8个）和48 h（5个）的生水牛乳样品聚集在一起，表明冷藏24、48 h水牛乳样品在种水平上嗜冷菌群落结构亦相似（R=0.068，P0.05）。和属水平规律相似，冷藏24 h水牛乳样品AM4、冷藏48 h水牛乳样品BM10~BM14与组内其他样品嗜冷菌种类存在差异。研究表明，不同冷藏时间嗜冷菌种水平上菌群结构组间有相似之处但同时存在组内个体差异，造成差异的原因可能是养殖模式和牧场管理水平等的不同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F005图5不同冷藏时间对生水牛乳种水平的PCoA分析2.3不同牧场规模生水牛乳中嗜冷菌多样性分析（见图6、图7）利用样本聚类和堆叠柱状图结合的图形进一步探讨分析不同牧场规模生水牛乳样品间嗜冷菌群落结构相似性。由图6可知，在属水平上，从牧场规模上分析嗜冷菌属菌落结构，奶站组（散户10~50头）的5个样品（24 h组AN1~AN5）均集中聚集在上部，主要优势嗜冷菌属包括假单胞菌属（22.1%）、不动杆菌属（22.1%）、链球菌属（15.6%）、莫拉菌属（12.4%）、乳球菌属（11.4%）、芽孢杆菌属（6.9%）等。采自牧场组（300~700头）的5个样品（24 h组AM2~AM3、48 h组BM7~BM9）集中聚集在中部，主要优势嗜冷菌属有链球菌属（39.9%）、不动杆菌属（38.4%）、乳球菌属（8.7%）、假单胞菌属（7.2%）等；采自牧场组（50~300头）的其他5个样品（48 h组BM10~BM14）集中聚集在下部，假单胞菌属（67.3%）为最主要的优势嗜冷菌属，其次是不动杆菌属（12.0%）。研究表明，相同的冷藏时间下，来自不同奶站和牧场的生水牛乳，其嗜冷菌属菌落结构相似度与养殖规模密切相关，也初步印证了冷藏24 h和冷藏48 h各自组内水牛乳样本存在个体差异的原因，对于规模较大的牧场（300~700头），在48 h内的嗜冷菌构成差异相对较小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F006图6属水平上嗜冷菌群落带聚类树的堆叠柱状图由图7可知，在种水平上，采自牧场组（50~300头）的3个样品（48 h组BM10、BM11、BM14）集中聚集在上部，主要的嗜冷菌菌种为荧光假单胞菌（16.3%）、韩国假单胞菌（5.0%）、鲍曼不动杆菌（4.9%）等。与属水平相同，采自奶站组（散户10~50头）的5个样品（24 h组AN1~AN5）集中在同一个分枝，聚类在中上部，优势嗜冷菌为鲍曼不动杆菌（20.0%）、猪链球菌（15.6%）、奥斯陆莫拉氏菌（12.4%）等；采自牧场组（300~700头）5个样品（24 h组AM2~AM3、48 h组BM7~BM9）也表现出和属水平一样的规律，集中聚集在下部，主要嗜冷菌菌种为猪链球菌（39.9%）、鲍曼不动杆菌（37.1%）、格氏乳球菌（6.3%）。研究表明，与属水平相似，种水平水牛乳样品嗜冷菌菌种结构组成受养殖规模的影响较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.016.F007图7种水平上嗜冷菌群落带聚类树的堆叠柱状图3讨论3.1不同冷藏时间对生水牛乳Alpha多样性的影响本试验结果显示，冷藏24 h生水牛乳中Simpson指数、Shannon指数、Chao1指数低于48 h，表明冷藏48 h生水牛乳样品的微生物多样性和丰富度高于冷藏24 h，因此可推测冷藏48 h生水牛乳的嗜冷菌多样性和丰富度高于冷藏24 h。Li等[20]采用高通量测序技术对生水牛中微生物多样性进行研究，发现不同冷藏时间的生水牛乳菌群结构具有差异性。3.2不同冷藏时间对生水牛乳中嗜冷菌多样性的影响本试验发现，不同冷藏时间生水牛乳中的假单胞菌属、不动杆菌属、链球菌属等主要嗜冷菌属对各组生水牛乳样品污染风险很高，与Li等[20]研究结果相同。本试验在属和种水平上的主坐标分析发现两组间相似度很高，整体嗜冷菌菌落结构差异不显著，与曹慧慧等[21]研究结果不一致。本研究中，冷藏48 h后生水牛乳样品中假单胞菌属已成为最主要嗜冷菌。Li等[20]研究发现，生水牛乳冷藏时间越长，假单胞菌属相对丰度越来越高。Von等[22]研究发现，假单胞菌属具有蛋白和脂肪水解能力，即使高温灭菌后仍能对乳及乳制品持续破坏。本试验发现，荧光假单胞菌是两组样品中主要假单胞菌属菌种。有文献报道，荧光假单胞菌是冷藏生乳中为常见优势嗜冷菌菌种，也是牛奶中主要品质破坏者[23]。已有学者发现，从生水牛乳中分离的荧光假单胞菌具有蛋白水解活性和产生生物膜的能力[24]，将进一步加剧原料奶的污染。本研究还发现，霉实假单胞菌、隆德假单胞菌、嗜冷假单胞菌、浅黄绿假单胞菌仅在冷藏48 h生牛乳样品中成为优势菌种，存在随着冷藏时间延长污染程度增加的风险。Marchand等[25]研究发现，在原料奶中分离出霉实假单胞菌和隆德假单胞菌是耐热蛋白酶的主要生产者，因此这些菌株可能是影响冷藏48 h生水牛乳品质重要危害嗜冷菌。研究发现，不动杆菌属是生牛乳中主要嗜冷菌属，在4 ℃条件下，其脂肪水解能力和形成生物膜的能力高达70%[26]。本研究种水平鉴定表明，鲍曼不动杆菌和约翰不动杆菌是生水牛乳不动杆菌属中主要优势菌种，Weber等[27]、Fricker等[28]选择其他原料乳也获得了相似结果。鲍曼不动杆菌通常与机会性感染、耐药性和医院感染有关，且动物中分离菌株与引起医院感染菌株具有不同的流行病学特征[29]。Mchugh等[30]也从牧场收奶罐和乳品加工企业的全脂牛奶罐中检出鲍曼不动杆菌为优势菌种。3.3不同牧场规模生水牛乳中嗜冷菌多样性分析原料乳中的微生物大多来自外界环境，嗜冷菌污染来源途径很多，其菌群结构与牧场饲养情况、环境卫生、基础设施、挤奶方式及挤奶设备等密切相关[31-32]。本研究发现，生水牛乳嗜冷菌菌种结构组成受养殖规模的影响较大。已有研究表明，牧场管理水平对嗜冷菌污染情况具有很大影响[33]，通常散户在奶牛健康、科学喂养、养殖环境、挤奶卫生、储奶卫生和信息管理等方面投入较低，而规模化牧场则管理更科学规范[34]。本研究通过聚类分析发现，在属和种水平上，生水牛乳样品嗜冷菌结构相似度均与养殖规模密切相关，按照养殖头数分为3种规模牧场，其主要优势嗜冷菌属有所不同。王娇[35]研究发现，从不同奶站分离出主要嗜冷菌为假单胞菌属。而本研究发现，奶站中以嗜冷菌属种类较多，还包括不动杆菌属和芽孢杆菌属等，这可能与奶站设备清洁和奶站环境方面有关。此外，Vithanage等[36]研究发现，在规模化牧场中生奶中最主要的优势嗜冷菌属均为假单胞菌属，与本研究中在奶站组和牧场组（50~300头）的结果一致，但与本试验牧场组（300~700头）发现的链球菌属（39.9%）为最主要优势属的结论不一致。假单胞菌属中韩国假单胞菌在奶站、50~300头牧场生牛乳中均为优势菌种，且在19个样品中均有检出，此菌具有产生蛋白酶和脂肪酶的能力，会对乳制品品质造成不良影响[16]。本研究还发现，不动杆菌属中Acinetobacter guillouiae相对丰度不高，但在所有样品中均有检出。已有研究从原料奶中分离出Acinetobacter guillouiae，其脂肪酶和酯酶活性为所有分离菌株中最强[37]，是生水牛乳中潜在危害菌。此外，芽孢杆菌属中蜡样芽孢杆菌是奶站样品中优势菌种，即使经过高温灭菌处理仍保持蛋白酶活性[38]。原料乳生产中嗜冷菌污染是常见的问题之一。本研究中，冷藏24 h和48 h嗜冷菌结构相似度较高，但优势菌仍然存在变化，冷藏贮存时间延长存在加剧生水牛乳中嗜冷菌的污染情况。因此，在生水牛乳加工前加强低温控制，缩短冷藏时间；还应注意对奶站及牧场生产环境的控制，规范挤奶，注意对接触牛奶物品的清洁消毒，以进一步控制乳与乳制品中的嗜冷菌繁殖。4结论本研究结果显示，不同冷藏时间（24、48 h）生水牛乳中嗜冷菌优势菌属为假单胞菌属、不动杆菌属、链球菌属、乳球菌属、金黄杆菌属等。随着冷藏时间延长，嗜冷菌污染风险增加的菌种分别是霉实假单胞菌、嗜冷假单胞菌、隆德假单胞菌、浅绿色假单胞菌等。不同牧场养殖规模聚类分析结果发现，在属和种水平上，生水牛乳样品嗜冷菌结构相似度和养殖模式及其规模密切相关。