荔枝叶是无患子科（Sapindaceae）植物荔枝（Litchi chinensis sonn）树的叶子，在《中华本草》中有相关记载。荔枝叶全年均可采摘，鲜用或者晒干，其味辛、微苦，性凉，具有除湿解毒功能，主治烂疮与湿疹[1]。荔枝主要分布于我国广东、广西、海南、福建、云南、四川等地[2]。荔枝果肉具有补脾、益肝、悦颜等功效，其树根、树叶等均可药用，为药食两用植物[3]。根据有关研究，荔枝叶主要成分以木脂素苷、黄酮苷、多糖、多酚类为主[4-5]，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抑菌、保肝、降血糖等药理作用[6-8]。魏磊等[9]研究发现，构叶中的黄酮成分抗菌活性显著，作为饲料添加剂能够有效防止传染性细菌疾病。而荔枝叶中也含有黄酮类成分，并具有一定的抗炎抑菌效果，将荔枝叶作为天然植物饲料添加剂进行研究，应用前景广阔。目前对荔枝叶活性成分的提取工艺主要集中于荔枝叶总黄酮提取工艺研究[10]、多糖的提取研究[11]以及通过正交法提取多酚类物质的工艺研究[12]。响应面法可以实现连续水平的优化，具有较好的预测性[13]，数据的可视化让试验结果更加直观，可以清楚地揭示各因素之间的相互作用，广泛应用于中药提取研究中[14-16]。但目前尚未发现运用响应面法对荔枝叶活性成分进行提取工艺优化的研究报道。鉴于此，本试验通过Box-Behnken响应面法筛选出荔枝叶活性成分的最优提取工艺条件，并初步探究其抗炎作用机制，旨在为荔枝叶在畜禽生产中的进一步开发应用提供参考。1材料与方法1.1试验仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司（美国））、FA2004B电子分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）、KH-500B超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、AJF-1001-B艾科浦超纯水机（重庆颐洋企业发展有限公司）、H1650-W医用离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）、311 CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）、DR-200Bs酶标仪（美国Diatek公司）。1.2药物与试剂荔枝叶采自广西陆川县，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为无患子科（Sapindaceae）植物荔枝（Litchi chinensis sonn）树的叶子。甲醇为色谱纯，水为超纯水，没食子酸（批号RP191126，纯度99.99%）、儿茶素（批号RP200829，纯度99.25%）、表儿茶素（批号RP190620，纯度99.82%）、芦丁（批号RP210601，纯度98.65%）、紫云英苷（批号RP190820，纯度99.19%）、槲皮素（批号RP200602，纯度99.25%）、山柰酚（批号RP200312，纯度99.83%），均购自成都麦德生科技有限公司，小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7（中国科学院上海生科院细胞资源中心），一氧化氮（NO）酶联免疫吸附试验测定试剂盒、白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附试验测定试剂盒均购自江苏晶美生物科技有限公司，ECL发光试剂盒（批号sc-2048，中杉金桥生物技术有限公司）。1.3试验方法1.3.1含量测定方法1.3.1.1对照品溶液制备分别称取没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚对照品适量，精密称定，采用甲醇溶解定容分别配成浓度为0.006 4、0.031 6、0.208 8、0.079 2、0.010 4、0.034 4、0.022 0 g/L的混合对照品溶液。1.3.1.2供试品溶液制备取荔枝叶粗粉2.0 g，精密称定，置干燥具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂36 mL（72%甲醇∶浓盐酸=30∶1），称重，35 ℃超声提取70 min，放冷，补重，摇匀，过滤，取续滤液2 mL，13 000 r/min离心10 min，取上清液即得。1.3.1.3色谱条件InertSustain C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脱（0~7 min，15%~23% A；7~14 min，23%~28% A；14~28 min，28%~38% A；28~30 min，38%~45% A；30~38 min，45%~48% A；38~53 min，48%~75% A）。检测波长为280、360 nm，28 min转为360 nm；流速为1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。混合对照品和荔枝叶供试品HPLC色谱图见图1。图1混合对照品和荔枝叶供试品的色谱图注：1为没食子酸，2为儿茶素，3为表儿茶素，4为芦丁，5为紫云英苷，6为槲皮素，7为山柰酚。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F1a1（a）混合对照品10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F1a2（b）荔枝叶供试品1.3.2方法学考察1.3.2.1线性关系考察分别精密吸取“1.3.1.1”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL移至10 mL容量瓶中定容，按“1.3.1.3”项下色谱条件进样。以样品浓度（g/L）对峰面积（A）进行线性拟合，绘制标准曲线得到7个成分的回归方程。1.3.2.2精密度试验取“1.3.1.1”项下混合对照品溶液，按照“1.3.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录7个成分的峰面积值。1.3.2.3稳定性试验取荔枝叶粗粉，按照“1.3.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.1.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，记下7个成分的峰面积值。1.3.2.4重复性试验取同一批荔枝叶粗粉6份，按“1.3.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，在“1.3.1.3”项色谱条件下分别测定，记录7个成分的峰面积值。1.3.2.5加样回收试验取同一批荔枝叶粗粉6份，每份1 g，精密称定，分别加入一定量（对照品加入量∶供试品中含量≈1∶1）的没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚。按照“1.3.1.2”项方法制备供试品溶液，在“1.3.1.3”项色谱条件下进样，记录7个成分的峰面积值。1.3.3提取方法的选择及多指标综合评分方法的建立1.3.3.1提取方法的考察取荔枝叶粗粉约2.0 g，精密称定，置干燥具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，加一定量浓盐酸（甲醇∶浓盐酸=30∶1），分别考察不同提取方法（超声法、水浴法、回流法）对没食子酸等7个成分含量的影响。1.3.3.2多指标综合评分方法建立依据提取方式考察的试验结果，可得到荔枝叶中7个成分的含量，按照含量高低分别给予各成分不同的权重系数。由超声提取法可知各组分的总含量为3.772 7 mg/g，其中没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素和山柰酚比重分别为1.24%、13.77%、41.55%、20.59%、3.76%、13.13%、5.96%。因此，将7个成分的权重系数依次设置为2%、14%、40%、20%、4%、14%、6%。参考文献[17]方法，计算各试验组综合评分值Y：Y=没食子酸含量/没食子酸含量max×2%+儿茶素含量/儿茶素含量max×14%+表儿茶素含量/表儿茶素含量max×40%+芦丁含量/芦丁含量max×20%+紫云英苷含量/紫云英苷含量max×4%+槲皮素含量/槲皮素含量max×14%+山柰酚含量/山柰酚含量max×6%)×100(1)1.3.4单因素试验设计1.3.4.1提取浓度的考察取荔枝叶粗粉约2.0 g，精密称定，置干燥具塞锥形瓶中，加入不同浓度的（30%、50%、70%、80%、90%、100%）甲醇15 mL，加一定量浓盐酸（甲醇∶浓盐酸=30∶1），称重，超声提取40 min，考察不同甲醇浓度对综合评分的影响。1.3.4.2提取体积的考察取荔枝叶粗粉约2.0 g，精密称定，置干燥具塞锥形瓶中，精密加入不同体积（15、20、25、30、35、40 mL）的80%甲醇，加一定量浓盐酸（80%甲醇∶浓盐酸=30∶1），称重，超声提取40 min，考察不同甲醇体积对综合评分的影响。1.3.4.3提取时间的考察取荔枝叶粗粉约2.0 g，精密称定，置干燥具塞锥形瓶中，精密加入35 mL的80%甲醇，加一定量浓盐酸（80%甲醇∶浓盐酸=30∶1），称重，超声提取20、40、60、80、100、120 min，考察不同提取时间对综合评分的影响。1.3.4.4提取温度的考察取荔枝叶粗粉约2.0 g，精密称定，置干燥具塞锥形瓶中，精密加入35 mL的80%甲醇，加一定量浓盐酸（80%甲醇∶浓盐酸=30∶1），称重，超声提取80 min，提取温度为30、35、40、45、50、60 ℃，考察不同提取温度对综合评分的影响。1.3.5Box-Behnken响应面优化试验（见表1）结合单因素试验结果，并依据Box-Behenken响应面法的设计原理，以甲醇提取浓度、提取体积及提取时间为考察因素，以单因素试验中最优结果为中心，围绕中心上下取一个水平作为响应面水平，以荔枝叶7个成分含量的综合评分（Y）为响应值，设计三因素三水平共17个试验点的响应面分析模型。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.T001表1响应面试验因素水平设计水平A提取浓度/%B提取体积/mLC提取时间/min-17030600803580190401001.3.6体外抗炎作用研究1.3.6.1荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞NO释放的影响取处于对数生长期RAW264.7细胞，使用完全培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至96孔板中。放在37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养。试验分组为对照组（DMEM培养）、LPS组（1 mg/L）、加药组。LPS组和加药组分别加入不同浓度荔枝叶醇提物（12.5、25.0、50.0 mg/L）预处理2 h，接着加入LPS（1 mg/L）刺激细胞一同孵育24 h。24 h后依据NO试剂盒的操作说明，在15 min内通过ELISA法在450 nm波长处测量各孔的OD值，计算培养液上清中NO的含量。1.3.6.2荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β炎症因子释放的影响细胞分组及处理同“1.3.6.1”。按照IL-1β酶联免疫吸附试验测定试剂盒的操作说明，测定各孔OD值，并计算各组细胞中分泌炎症因子IL-1β的含量。1.3.6.3荔枝叶醇提物对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS表达的影响收集对数生长期RAW264.7细胞沉淀，调整细胞密度，接种到12孔板。放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。试验分组同“1.3.6.1”。其中药物组分别加入不同浓度荔枝叶醇提物（12.5、25.0、50.0 mg/L）预处理2 h，接着加入LPS（1 mg/L）刺激细胞一同孵育24 h。去除上清培养液，收集细胞并提取蛋白，细胞蛋白提取完成后，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书，定量蛋白上样量。提取细胞蛋白定量后，采用Western Blot法检测iNOS蛋白表达，以GAPDH作为内参照，比较不同处理后iNOS蛋白表达的差异。1.3.6.4实时荧光定量PCR（QPCR）检测荔枝叶醇提物对脂多糖诱导RAW264.7细胞NF-κB mRNA和TLR4 mRNA表达水平的影响取处于对数生长期RAW264.7细胞，调整细胞密度，接种至12孔板中，根据“1.3.6.1”进行细胞分组。放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。其中药物组分别加入不同浓度荔枝叶醇提物（12.5、25.0、50.0 mg/L）预处理2 h，接着加入LPS（1 mg/L）刺激细胞一同孵育24 h。采用QPCR法检测NF-κB mRNA和TLR4 mRNA表达。1.4数据统计与分析运用GraphPad Prism 5.0软件进行数据统计分析，数据以“平均值±标准差”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1方法学考察结果2.1.1线性关系考察结果（见表2）由表2可知，没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚在相应范围内线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.T002表2荔枝叶7个成分线性关系化学成分回归方程R线性范围/(g/L)没食子酸y=16 747.935 8x-0.695 985 40.999 50.000 6~0.006 4儿茶素y=7 150.485 14x-1.385 112 40.999 90.003 2~0.031 6表儿茶素y=7 548.668 55x-9.557 339 20.999 70.020 9~0.208 8芦丁y=17 728.276 1x+1.701 227 00.999 60.007 9~0.079 2紫云英苷y=27 737.789 8x-1.532 456 30.999 80.001 0~0.010 4槲皮素y=37 861.340 9x-8.991 968 90.999 80.003 4~0.034 4山柰酚y=55 111.536 3x-3.465 437 30.999 90.002 2~0.022 02.1.2精密度试验结果没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的峰面积RSD为1.15%、0.45%、1.00%、0.12%、0.30%、0.20%、0.14%，RSD＜3.00%，表明仪器精密度良好。2.1.3稳定性试验结果没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的峰面积RSD分别为0.28%、2.79%、2.91%、0.19%、1.00%、0.55%、0.67%，RSD＜3.00%，表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。2.1.4重复性试验结果没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的含量RSD值为0.97%、1.85%、2.52%、2.46%、1.86%、2.83%、2.88%，RSD＜3.00%，表明该方法重复性良好。2.1.5加样回收试验结果没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的加样回收率分别为101.81%、102.32%、102.05%、98.99%、99.30%、100.51%、99.82%；RSD分别为2.45%、1.59%、1.75%、2.91%、2.58%、2.22%、2.46%，结果表明该方法准确率良好。2.2提取方法考察结果（见表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.T003表3不同提取方法对荔枝叶7个成分总含量的影响（n=3）序号提取方式没食子酸儿茶素表儿茶素芦丁紫云英苷槲皮素山柰酚总含量1超声0.046 70.519 61.567 40.776 80.141 70.495 50.224 93.772 72回流0.041 10.244 00.839 00.343 40.081 60.561 30.240 82.351 23水浴0.047 00.483 10.903 20.304 10.081 50.981 50.431 43.231 7mg/g经过比较超声、回流、水浴3种方法，发现超声法提取得到的7个成分的总含量较高。因此，本试验选择超声法作为提取方法。2.3单因素试验结果2.3.1提取浓度对综合评分的影响（见图2）由图2可知，随着甲醇浓度增大，荔枝叶各成分的溶出率降低，可能各成分溶出的同时促使其他杂质溶出，相互反应生成了其他物质，使用80%甲醇提取时效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F002图2提取浓度对综合评分的影响2.3.2提取体积对综合评分的影响（见图3）由图3可见，随着甲醇体积的增加，荔枝叶各成分逐渐溶解，当甲醇体积达到35 mL时，各成分已得到充分溶解，因此提取体积为35 mL时效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F003图3提取体积对综合评分的影响2.3.3提取时间对综合评分的影响（见图4）由图4可知，不同的提取时间对提取荔枝叶成分的提取效果影响不同，随着超声提取时间的增加，综合评分也会逐步增大。综合评分在提取时间从20 min上升至80 min时增加的速度较快；提取时间超过80 min后处于缓慢上升趋势，变化不大且趋于平稳，此时荔枝叶成分的已得到较好提取，增加提取时间会造成能源浪费。同时考虑超声时间过长可能会增加其他杂质成分，出于节约资源、降低时间成本的原因，提取时间选择80 min左右即可。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F004图4提取时间对综合评分的影响2.3.4提取温度对综合评分的影响（见图5）由图5可知，当提取温度为35 ℃时效果最好，当温度超过35 ℃时，荔枝叶各成分可能会被破坏，从而导致提取率下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F005图5不同提取温度对综合评分的影响2.4响应面试验结果2.4.1响应面试验设计及结果（见表4、表5）由Design-Expert 8.0.6软件分析得到二次多项回归方程为：Y=81.01-4.34A+1.88B-1.91C+1.32AB+5.24AC+0.68BC-3.45A2-1.98B2-4.00C2，R2=0.839 1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.T004表4Box-Behnken试验设计及结果序号A提取浓度/%B提取体积/mLC提取时间/min综合评分Y170308082.39290308065.38370408083.14490408071.41570356082.90690356069.447703510067.198903510074.70980306074.851080406077.6311803010071.0712804010076.571380358084.311480358078.971580358078.651680358082.151780358080.95由表5可知，模型P0.05，表明回归模型具有显著性意义，以该模型评价本试验的可行度较高；失拟项P0.05，表明失拟项不具有显著性意义，表明模型选择合适，可以用该模型进行分析和预测；R2=0.839 1，表明模型拟合程度良好。模型一次项A及交互项AC对综合评分Y的影响显著（P0.05），一次项B、C，交互项AB、BC，二次项A2、B2、C2对综合评分影响无统计学意义（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.T005表5方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型474.85952.764.060.039 2A150.421150.4211.560.011 4B28.35128.352.180.183 4C29.22129.222.250.177 6AB6.9716.970.540.488 0AC109.941109.948.450.022 8BC1.8511.850.140.717 3A250.09150.093.850.090 5B216.45116.451.260.297 8C267.14167.345.180.057 0残差91.06713.01失拟项69.14323.054.200.099 5纯误差21.9245.48总离差565.9116注：P0.05表示影响显著。利用Design-Expert 8.0.6统计软件对回归方程进一步分析，获得荔枝叶超声提取法的最佳工艺条件为：提取浓度为71.59%，提取体积为35.51 mL，提取时间为68.58 min，此条件下模型预测的综合评分为84.53。为了实际操作更简便，对提取荔枝叶最佳的工艺条件进行修正，因而设定提取浓度为72%，液料比为18 mL/g，提取时间为70 min，在此条件下进行3次验证试验。2.4.2各因素交互作用对综合评分的影响（见图6~图8）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F006图6提取浓度与提取体积交互作用对综合评分的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F007图7提取浓度与提取时间交互作用对综合评分的影响由图6~图8可知，提取浓度（A）与提取时间（C）的交互作用对荔枝叶提取工艺的综合评分影响显著，与表5方差结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F008图8提取体积与提取时间交互作用对综合评分的影响2.5验证试验结果（见表6）按照修正后的工艺条件进行3次平行验证试验，测得没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的平均含量为0.058 6、0.305 4、2.007 4、0.858 0、0.111 9、0.362 1、0.085 2 mg/g，实际得到的荔枝叶综合评分平均值为88.99（RSD=1.99%，n=3），与模型预测值相差不大。研究表明，该模型预测性良好，说明优化工艺条件稳定、可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.T006表6验证试验结果（n=3）序号没食子酸/（mg/g）儿茶素/（mg/g）表儿茶素/（mg/g）芦丁/（mg/g）紫云英苷/（mg/g）槲皮素/（mg/g）山柰酚/（mg/g）综合评分RSD/%10.057 70.246 52.253 40.944 90.103 90.328 50.073 290.801.9920.059 30.392 11.864 10.832 00.106 90.373 40.090 089.5830.058 90.277 41.904 80.797 20.124 80.384 40.092 386.58平均值0.058 60.305 42.007 40.858 00.111 90.362 10.085 288.992.6体外抗炎作用研究结果2.6.1荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞NO释放的影响（见图9）由图9可知，正常RAW264.7细胞中NO分泌量较少，加入LPS诱导后，细胞中NO释放量显著增加，表明已经完成RAW264.7细胞炎症模型的构建。荔枝叶醇提物与LPS共同孵育24 h后，荔枝叶醇提物高、中、低浓度组NO分泌量与LPS组相比显著减少（P0.001），表明荔枝叶醇提物能降低炎症巨噬细胞NO的释放。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F009图9荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞NO释放的影响注：与LPS组比较，“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）；下图同。2.6.2荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β炎症因子释放的影响（见图10）由图10可知，浓度为1 mg/L的LPS诱导RAW264.7细胞后，IL-1β炎症因子的分泌量与对照组相比显著增加，表明RAW264.7细胞炎症模型已成功构建。荔枝叶醇提物与LPS共同作用24 h后，与LPS组相比，荔枝叶醇提物高、中、低浓度组的IL-1β分泌量显著减少（P0.001），表明荔枝叶醇提物能抑制炎症巨噬细胞中IL-1β炎症因子的分泌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F010图10荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β影响2.6.3荔枝叶醇提物对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS表达的影响（见图11）由图11可知，与对照组相比，LPS组iNOS蛋白相对表达量显著增高，表明成功构建了RAW264.7细胞炎症模型。与脂多糖组比较，荔枝叶醇提物低、中、高质量浓度组iNOS蛋白相对表达量明显降低（P0.001），表明荔枝叶醇提物能降低iNOS蛋白表达。图11荔枝叶醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞iNOS表达的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F11a1（a）RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的蛋白条带10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F11a2（b）RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的灰度值2.6.4实时荧光定量PCR（QPCR）检测荔枝叶醇提物对脂多糖诱导RAW264.7细胞NF-κB mRNA和TLR4 mRNA表达水平的影响（见图12）由图12可知，与对照组比较，LPS组的NF-κB mRNA表达水平显著提高，TLR4 mRNA表达水平呈下降趋势。与LPS组相比，荔枝叶醇提物低、中、高浓度组的NF-κB mRNA表达水平均显著降低（P0.001），TLR4 mRNA表达水平均显著增高（P0.05）。研究表明，荔枝叶醇提物能降低NF-κB mRNA，增加TLR4 mRNA蛋白表达水平。图12荔枝叶醇提物对NF-κB mRNA、TLR4 mRNA表达水平的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F12a1（a）NF-κB mRNA10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.015.F12a2（b）TLR4 mRNA3讨论通过对荔枝叶药材样品进行全波长扫描和紫外分光光度测定，结果发现全波长扫描图中色谱峰信息较多的位置为280、360 nm处，紫外分光光度法结果显示在260~300 nm处，没食子酸、儿茶素、表儿茶素存在最大吸收，在340~380 nm处，芦丁、紫云英苷、槲皮素、山柰酚都存在最大吸收。因为这7个成分的吸收波长存在差异，所以本试验运用HPLC波长切换法测定荔枝叶的指标成分。本试验采用梯度洗脱分离荔枝叶药材中的成分。考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸等流动相系统，发现在甲醇-0.2%磷酸流动相下色谱图基线平稳且色谱峰分离度较好。考察了0.8、1.0、1.2 mL/min共3种流速对色谱峰的影响程度，结果发现在流速1.0 mL/min下，色谱峰较尖锐对称且分离度较好；考察了25、30、35 ℃的柱温对色谱峰的影响，发现当温度为35 ℃时，色谱峰基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形较尖锐。故最后确定色谱条件为甲醇-0.2 %磷酸作为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃。响应面优化法是一种结合数理统计、试验设计与最优化技术的综合应用方法，近年来常被广泛应用于优化试验提取工艺的研究上。吴国宏等[12]采用正交试验确定了荔枝叶中的多酚制备的工艺，此方法仅能通过数据表和折线图去判断各考察因素对多酚提取效果的影响。而本研究采用的响应面法可通过三维图形更清楚、更直观地判断各因素对响应值的影响，可通过建立模型，拟合函数方程，通过分析响应值和各因素间关系，从而得到最佳工艺条件。有研究报道黄酮类化合物在畜牧业中应用广泛。卢宁等[18]研究发现芦丁在猪、反刍动物、家禽与水产动物生产中均有不同程度的应用，发挥着不同功效。林丽明等[19]研究发现槲皮素有助于提高动物的生产性能，具有调节动物免疫能力功能，能够改善动物肠道健康。芦丁、槲皮素作为黄酮类化合物的代表成分，在动物生产中具有潜在的应用价值，本研究采用响应面法优化了荔枝叶的提取工艺，发现荔枝叶中芦丁与槲皮素的含量相对较高，说明此方法可以提高二者的利用率，也挖掘出荔枝叶的开发利用价值，使其有望成为一种新型的饲料添加剂应用于动物生产中。4结论本试验确定了荔枝叶最优的提取工艺参数为甲醇提取浓度为72%、液料比为18 mL/g、超声提取时间为70 min。在此条件下以脂多糖诱导RAW264.7细胞作为炎症模型，研究荔枝叶抗炎的作用机制。试验结果表明荔枝叶能够抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO释放以及IL-1β的分泌；降低iNOS蛋白表达；降低NF-κB mRNA与增加TLR4 mRNA的蛋白表达水平。