葡萄皮中的多酚类物质具有抗氧化、抗过敏、抑菌防癌抗肿瘤、预防心脑血管等疾病及延缓机体衰老等功能[1-2]。植物多酚是一种天然的抗氧化物，具有延缓机体衰老，抗凝血，降低血脂、血压，预防糖尿病，增强免疫力等作用[3-5]。植物多酚对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、黑曲霉、青霉等具有抑制作用[6]。现阶段，只有很少一部分葡萄皮渣被用于动物饲料、农作物肥料，大部分被废弃，不仅造成了大量资源浪费，还对环境造成了严重的污染[7-9]。因此，本研究预选用溶剂提取法对葡萄皮渣中的多酚物质进行提取，考察多酚提取过程中的影响因素，并进行优化确定最佳提取条件；同时探究多酚对食源性致病菌的抑制作用，进一步为葡萄皮渣中多酚在畜牧水产中的综合利用提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验样品葡萄皮渣为葡萄酒厂的皮渣废弃料。1.1.2试验试剂金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌由学校实验室提供。无水乙醇、无水碳酸钠、福林酚、没食子酸购自广州化学试剂厂。1.1.3主要仪器723可见分光光度计（安徽科学器材有限公司）、FD-1冷冻干燥机（深圳德宝斯科技有限公司）、隔水式电热恒温培养箱（宁波新艺生物科技有限公司）、DFY-1000C小型高速万能粉碎机（大德药机生产厂家）、数显恒温磁力搅拌器（河南天辰仪器设备有限公司）、JA21002电子分析天平（长春乐镤科技有限公司）、HH-8数显恒温水浴锅（杭州瑞诚仪器有限公司）。1.1.4样品预处理葡萄皮渣清洗后，经冷冻干燥后，使用小型高速万能破碎机将其粉碎[9]。将得到的葡萄皮渣干粉密封存放于阴凉干燥处备用。1.2试验方法1.2.1醇溶法提取葡萄皮渣中多酚物质称取10 mg预先处理好的葡萄皮渣干粉于锥形瓶中，再按一定比例加入适量体积分数的乙醇溶液，封住瓶口，将其置于恒温水浴中浸泡一定时间。1.2.2标准溶液的制备称取没食子酸10 mg放入烧杯中，将其配制成浓度为0.1 g/L的标准溶液。向5个10 mL的褐色容量瓶中移取没食子酸标准溶液100、200、400、600、800 µL，使用去离子水添加到2.0 mL。加入1.0 mL的福林酚试剂和4.0 mL Na2CO3饱和溶液，加入去离子水定容至10 mL，混合均匀，在室温下静置2 h。1.2.3标准曲线的绘制以没食子酸的不同质量浓度为横坐标，以在波长760 nm处测定的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.4多酚含量将多酚提取液使用去离子水补充到25 mL，取多酚提取液25 µL，置于10 mL褐色容量瓶中。通过福林酚法进行提取液吸光度的测定，将吸光度值代入没食子酸标准曲线方程中，求出葡萄皮渣多酚含量。1.2.5葡萄皮渣多酚提取单因素试验称取一定量的葡萄皮渣干粉，控制试验中的其他条件不变，改变其中一个影响因素进行试验。根据上述方法，测定多酚提取量及其与各因素间是否有显著关系。1.2.5.1液料比对葡萄皮渣多酚的影响通过预试验和郝俊光等[10]试验方法，将葡萄皮渣多酚提取过程中浸提温度设置在45 ℃，浸提时间设置7 h，乙醇体积分数设置在50%，将液料比设置为7、9、11、13、15、17 mL/g。以葡萄皮渣多酚提取率作为检测指标，研究液料比的最适添加量。1.2.5.2乙醇体积分数对葡萄皮渣多酚的影响将葡萄皮渣多酚提取过程中浸提温度设置在45 ℃时，浸提时间设置为7 h，液料比设置为15 mL/g，通过预试验和张柳婷等[11]试验方法，将乙醇体积分数设置为30%、40%、50%、60%、70%。以葡萄皮渣多酚提取率作为检测指标，研究乙醇体积分数的最适添加量。1.2.5.3提取温度对葡萄皮渣多酚的影响将葡萄皮渣多酚提取过程中提取时间设置为7 h，液料比设置为15 mL/g，乙醇体积分数设置为50%，通过预试验和汪涛等[12]试验方法，将提取温度分别设置为35、45、55、65、75 ℃。以葡萄皮渣多酚提取率作为检测指标，研究浸提温度的最佳水平。1.2.5.4提取时间对葡萄皮渣多酚的影响将葡萄皮渣多酚提取过程液料比设置为15 mL/g，乙醇体积分数设置为50%，提取温度分别设置为55 ℃。通过预试验和申凯等[13]试验方法，将提取时间设置为3、5、7、9、11 h。以葡萄皮渣多酚提取率作为检测指标，研究浸提时间的最佳水平。1.2.6正交试验以多酚得率为指标，进行四因素三水平试验，探讨葡萄皮渣中多酚提取的最佳工艺条件。L9（34）正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.T001表1正交试验因素水平设计水平A乙醇体积分数/%B提取温度/℃C提取时间/hD液料比/(mL/g)1454061325045715355508171.3抑菌试验1.3.1菌种与菌悬液的配制结合文献[14-15]的试验方法，稍微改动。在准备好的牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基中分别接种大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌，于37 °C下培养24 h。将l mL的无菌水分别加到细菌培养基中，使用接种环把培养好的致病菌的菌落刮下挑取一环，接入无菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，放置备用。1.3.2葡萄皮渣多酚的抑菌活性分别移取1 mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、沙门氏菌的菌悬液于5个灭菌的培养皿中均匀涂布，静置。每一种细菌培养基中放入3张注入配好的葡萄皮渣多酚溶液的无菌滤纸圆片和1张注有与多酚溶液等量的无菌生理盐水的滤纸圆片作对照。将4张滤纸片对称放入细菌培养基上，37 °C静置24 h后记录多酚物质对细菌的抑制情况。根据上述试验步骤，依次提高多酚浓度，进一步考察多酚抑菌活性的效果。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行统计处理，SPSS 26软件进行单因素方差分析，LSD法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1标准曲线的绘制（见图1）由图1可知，没食子酸浓度与吸光度值具有一定的线性关系，没食子酸的标准曲线方程为：y=0.110 35x+0.014 28，相关系数为R2=0.999 8。因此，可以用于葡萄皮渣多酚提取含量的测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.F001图1没食子酸标准曲线2.2单因素试验结果2.2.1液料比对葡萄皮渣多酚提取率的影响（见图2）由图2可知，当液料比提高，多酚提取率随之升高，且上升速率较快。但液料比为13 mL/g时，继续提高液料比，多酚提取量上升速率并不显著，且逐渐趋于平缓。选择合适的液料比，有助于能源节约、成本降低。所以，选择15 mL/g为最佳的液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.F002图2液料比对葡萄皮渣多酚提取率的影响2.2.2乙醇体积分数对葡萄皮渣多酚提取率的影响（见图3）由图3可知，乙醇体积分数调整为30%~40%时，多酚类物质提取量明显上升，且速率较快。多酚提取量在乙醇体积分数增加到50%以上时，开始明显下降，且速率快。主要原因可能是多酚类物质存在能与植物中的其他物质形成氢键的结构，使部分乙醇被消耗掉。因此乙醇体积分数过高时，反而会降低葡萄皮渣中多酚类物质的提取。所以，乙醇体积分数应选择50%为最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.F003图3乙醇浓度对葡萄皮渣多酚提取率的影响2.2.3温度对葡萄皮渣多酚提取率的影响（见图4）由图4可知，提取温度在35~40 °C时，多酚类物质提取量上升，速率较快。在提取温度为40~50 °C时，多酚物质提取量上升速率逐渐缓慢并不显著。浸提温度大于50 °C时，多酚提取量开始显著下降。原因可能是葡萄皮渣中多酚物质在过高的温度下被破坏，从而导致多酚类物质的提取量降低[12-13]。因此，选用50 °C为后续试验最佳的提取温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.F004图4提取温度对葡萄皮渣中多酚提取率的影响2.2.4提取时间对葡萄皮渣多酚提取率的影响（见图5）由图5可知，提取时间在3~5 h之间时，多酚类物质提取量上升明显，且速率快。当时间持续延长至7 h，多酚物质提取量开始明显下降；提取时间为7 h时，多酚提取量达到最多。在提取时间持续延长下，多酚类物质的提取量却开始减少，这可能由于葡萄皮渣的多酚物质在长时间的加热情况下，导致多酚物质被破坏，致使多酚物质提取量随着时间的延长而逐渐降低[14]。所以，应选择7 h为最佳的提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.F005图5提取时间对葡萄皮渣多酚提取率的影响2.3正交试验结果（见表2）由表2可知，以醇溶法从葡萄皮渣中提取多酚类物质的最优水平为A1B3C3D2，各个因素对多酚提取率的影响大小是：BCDA，可以看出提取温度对多酚提取量影响较大，乙醇体积分数对多酚提取量影响最小。所以，要使提取的多酚量得到最大化，应使用45%的乙醇体积分数、15 mL/g的液料比，在50 °C的温度下提取8 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.T002表2正交试验结果项目ABCD多酚得率/(mg/g)1111112.682122212.753133315.674212313.045223112.466231215.067313214.838321312.089332113.36K141.1040.5539.8238.68K240.5637.2939.1542.64K340.2744.0842.9640.79k113.7013.5113.2713.89k213.5212.4313.0514.21k313.4214.6914.3213.60R0.282.261.270.612.4验证试验选择最佳的葡萄皮渣多酚提取工艺条件进行3次平行试验，得出多酚提取量为16.70%、16.18%、16.62%，平均值为16.50%，与正交试验数据大致相同。2.5葡萄皮渣多酚物质抑菌结果（见表3）抑菌圈直径越大，说明多酚的抑菌效果越明显[15-16]。由表3可知，5种常见的食源性致病菌在葡萄皮渣中多酚物质的作用下被明显抑制。继续增加多酚物质的浓度，滤纸片上的细菌越少，抑菌圈直径也逐渐变大，表明葡萄皮渣中的多酚物质对金黄色葡萄球菌抑制效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.014.T003表3不同质量浓度的葡萄皮渣多酚提取物抑菌效果项目抑菌圈直径/mm金黄色葡萄球菌沙门氏菌大肠杆菌单增李斯特菌志贺氏菌4 g/L多酚13.513.412.811.412.86 g/L多酚15.415.113.412.213.18 g/L多酚16.816.114.813.214.410 g/L多酚18.017.515.913.815.112 g/L多酚19.518.816.814.415.8对照3.53.53.53.53.53讨论葡萄皮渣中富含花色苷、膳食纤维和多酚类物质等营养物质，合理利用处理后可作为动物饲料，也可作为肥料用于农业生产[17]，不仅能够避免资源浪费，同时增加了葡萄产业附加值。常见的多酚提取溶剂有水、乙醇、丙酮以及乙酸乙酯等极性大的溶剂[18]。本试验采用醇溶法，提取出葡萄皮渣中多酚物质，该方法清洁、简便、操作容易控制[19]。本试验结果显示，当液料比15 mL/g、乙醇体积分数45%时，50 ℃提取8 h，可使多酚从葡萄皮渣中提取含量达到16.50 mg/g，略低于齐岩等[20]利用超声辅助提取葡萄皮渣中多酚提取量，原因主要是本研究操作过程未进行超声辅助提取导致。但本研究优化的提取工艺不耗能，容易控制提取条件，更加适合工业化生产操作。4结论本研究以葡萄皮渣为原料，研究了葡萄皮渣中多酚提取率及其抑菌活性。试验结果表明，液料比15 mL/g、乙醇体积分数45%时，50 °C提取8 h，可以得到最佳的多酚提取量，为16.50 mg/g。同时，葡萄皮渣中多酚类物质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特菌5种常见致病菌呈现明显的抑制作用。