纤维素是自然界中来源最丰富的可再生资源[1-2]，如果得不到合理利用，不仅浪费资源，还会造成环境污染[3]。目前，利用天然纤维素最环保有效的途径是通过微生物降解[4-5]。在能够降解纤维素的微生物中，真菌酶系全、酶量大、酶活高[6]。研究较多的真菌酶主要有曲霉属、木霉属、青霉属等[7]。纤维素酶是由多种酶组成的复合酶系[8]，包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等，通过各组分之间的协同作用将纤维素分解为葡萄糖分子[9]。利用纤维素酶将自然界中的纤维素物质转化为食品和能源化工原料，对解决全球能源短缺、动物饲料资源紧张和环境污染问题等有重大意义[10-11]。青藏高原微生物资源丰富，微生物对高原特殊生态环境产生特有的生理适应机制[12]。研究从青藏高原高寒草甸土壤中分离纤维素降解菌，通过刚果红水解圈法和DNS法测定菌株的纤维素酶活力，筛选出高效纤维素降解菌，并对菌株进行分类鉴定，对其进行发酵条件优化和酶学性质研究，为纤维素资源应用提供优质菌种资源。1材料和方法1.1试验材料1.1.1菌种采用梅花采样法于青海省门源县（3 175 m，37 N101 E）收集土壤样品，过筛，-20℃冷冻保存。1.1.2培养基筛选性培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5.0 g/L、NaNO3 3.0 g/L、K2HPO4 1.31 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、琼脂粉20.0 g/L，pH值5.5~6.0、121 °C灭菌20 min。纯化培养基：马铃薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、琼脂粉20.0 g/L，pH值5.5~6.0、121 °C灭菌20 min。发酵培养基：CMC-Na 5.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、NaNO3 3.0 g/L、K2HPO4 1.31 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH值5.5~6.0、121 °C灭菌30 min。1.1.3试剂与仪器试剂：DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂配置方法参考文献[13]；CMC-Na购自国药集团化学试剂有限公司；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自上海生工有限公司；刚果红购自天津市风船化学试剂有限公司；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司。仪器：酶标仪购自Bio-Rad laboratories Inc；生物显微镜购自OLYMPUS有限公司；气浴恒温振荡器、高压灭菌锅购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；恒温水浴锅购自上海科銮仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1产纤维素酶菌株筛选初筛：用无菌水稀释样品至10-3倍，取200 μL均匀涂布于筛选培养基，28 ℃培养72 h。选取单菌落接种于纯化培养基，纯化后的菌株点种于筛选培养基，28 ℃培养72 h。用刚果红染色法，选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株为初筛菌株。复筛：初筛菌株于发酵培养基（28 ℃、200 r/min）培养72 h，取培养液12 000 r/min离心10 min，制备粗酶液。取粗酶液测定纤维素酶活力，酶活力最高菌株为目的菌株。1.2.2纤维素酶活力的测定采用DNS法测定菌株产纤维素酶活力。50 μL粗酶液与450 μL底物（1% CMC-Na溶液）混匀，40 ℃反应10 min后加入750 μL DNS，终止反应，沸水浴10 min显色，冷却至室温后，于540 nm波长处测定吸光度，对照组粗酶液沸水浴5 min灭活。酶活定义：在40 ℃、pH值6条件下，1 min水解1% CMC-Na溶液产生1 μmoL还原糖的酶量作为1个酶活力单位（U/mL）。1.2.3菌株鉴定方法形态学鉴定：用筛选培养基28 ℃培养目的菌株，插片培养法观察菌丝形态特征。分子生物学鉴定：用真菌基因组快速抽提试剂盒提取目的菌株基因组。通用引物ITS1和ITS4扩增目的菌株ITS区基因序列，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送至上海生工有限公司测序。测序结果上传值NCBI，进行序列比对。1.2.4菌株发酵条件的优化1.2.4.1碳源对菌株产纤维素酶的影响目标菌株分别在以3%（质量体积比）的麸皮、花生秧、玉米秸秆、玉米芯、木聚糖、葡萄糖、蔗糖、CMC-Na为碳源的发酵培养基上28 ℃、200 r/min振荡培养72 h，测定纤维素酶活力。培养基中分别添加1%、2%、3%、4%、5%的最佳碳源，相同条件培养目标菌株，测定纤维素酶活力。1.2.4.2氮源对菌株产纤维素酶的影响目标菌株分别在以1%（质量体积比）的硝酸钠、硫酸铵、尿素、酵母粉、豆粉、蛋白胨为氮源的发酵培养基上，同上条件培养并测定纤维素酶活力。分别添加0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的最佳氮源于培养基中，相同条件培养目标菌株，测定纤维素酶活力。1.2.4.3金属离子对菌株产纤维素酶的影响发酵培养基中分别添加0.1%（质量体积比）的Fe3+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Na+、K+，同上条件培养目标菌株并测定纤维素酶活力。培养基中分别添加0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%最佳金属离子，相同条件培养目标菌株，测定纤维素酶活力。1.2.4.4培养条件优化发酵培养基基础上，考察培养温度（18、23、28、33、38 ℃）、pH值（5、6、7、8、9）、摇床转速（170、200、230 r/min）、接种量（2%、4%、6%、8%）对目标菌株产纤维素酶的影响，恒温振荡培养72 h测定纤维素酶活力。1.2.4.5营养条件正交试验设计发酵条件优化基础上，选择最佳碳源、氮源、金属离子为影响因子，采用L9(34)正交表进行正交试验，探究不同正交组合对菌株产酶的影响。设3个重复组。菌株SD10产酶条件正交试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.T001表1L9(34)正交试验因素水平设计水平A 玉米秸秆B 豆粉C Mn2+130102240153350204g/L1.2.4.6菌株生长曲线的测定目标菌株接种于优化培养基，最适培养条件下培养，间隔6 h取样一次，测定纤维素酶活力并测量菌体重量，绘制菌株生长曲线和产酶曲线。1.2.5酶学性质初步研究1.2.5.1温度对纤维素酶活力的影响在20、30、40、50、60、70 ℃条件下测定粗酶液纤维素酶活力，探究酶的最适反应温度。粗酶液在40、50、60、70 ℃分别保温5、10、15、20、25、30 min，50 ℃测定剩余纤维素酶活力，探究酶的温度稳定性。1.2.5.2pH值对纤维素酶活力的影响粗酶液与pH值为3、4、5、6、7、8、9的底物反应，50 ℃测定纤维素酶活力，探究酶的最适反应pH值。粗酶液与pH值为3、4、5、6、7、8、9的缓冲液1∶1混匀，保温1 h，50 ℃测定剩余纤维素酶活力，探究酶的pH值稳定性。1.2.5.3金属离子对纤维素酶活力的影响分别加入5 mmol/L的Fe3+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Na+、K+于反应体系中，以不添加金属离子的反应体系为对照组，50 ℃测定目标菌株纤维素酶活力。1.4数据统计与分析使用SPSS 20.0和Excel 2016进行方差分析和差异显著性分析。2结果与分析2.1产纤维素酶菌株的筛选（见图1）从青藏高原土壤样品中筛选出多株产纤维素酶菌株，比较透明圈直径与菌落直径比值和纤维素酶活力大小，选择一株产纤维素酶活力较高的菌株SD10，初筛纤维素酶活达到3.51 U/mL。由图1可知，菌株SD10具有明显的纤维素水解圈。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F001图1菌株SD10菌落透明圈2.2菌株SD10的鉴定（见图2）由图2可知，菌株SD10为浅珊瑚色绒毛状、菌丝松散不规则。菌丝有隔膜、分枝、多核，有卵圆形分生孢子，初步鉴定为脉孢菌属。经分子生物学鉴定，菌株SD10的ITS基因序列与已知菌株Neurospora crassa IYN65的ITS基因序列（登录号MT367687.1）相似度100%，确定菌株SD10为粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）。图2菌株SD10形态特征10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F00210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F0032.3粗糙脉孢菌SD10发酵条件优化2.3.1碳源对菌株SD10产纤维素酶活力的影响（见图3、图4）由图3可知，不同碳源对菌株SD10产纤维素酶能力有显著影响（P0.05）。相比于单一碳源，复合碳源培养的菌株产纤维素酶活力更高。以玉米秸秆为碳源时纤维素酶活力最高。葡萄糖作为纤维素酶的催化产物，使酶的合成过程受阻，降低了纤维素酶活力[14]。因此，选择玉米秸秆作为最佳碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F004图3碳源对菌株SD10产纤维素酶活力的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。由图4可知，玉米秸秆添加量由1%增加到5%时，纤维素酶活力先升高后降低，玉米秸秆添加量为3%时纤维素酶活力最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F005图4玉米秸秆添加量对菌株SD10产纤维素酶活力的影响2.3.2氮源对菌株SD10产纤维素酶活力的影响（见图5、图6）由图5可知，菌株SD10利用有机氮源产酶的能力明显高于无机氮源，以豆粉为氮源时酶活力最高。因此，选择豆粉作为最佳氮源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F006图5氮源对菌株SD10产纤维素酶活力的影响由图6可知，豆粉添加量为1.5%时产酶量最高。因此，选择1.5%作为豆粉的最适添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F007图6豆粉添加量对菌株SD10产纤维素酶活力的影响2.3.3金属离子对菌株SD10产纤维素酶活力的影响（见图7、图8）由图7可知，发酵培养基中添加Mn2+时，SD10产纤维素酶活力较高，其次是Cu2+、Ca2+、Fe3+等，Zn2+对菌株SD10产纤维素酶活力有明显的抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F008图7金属离子对菌株SD10产纤维素酶活力的影响由图8可知，随着培养基中Mn2+浓度的增加，酶活力先增后降，添加量为0.20%时菌株产酶量最高。因此，选择0.20%为Mn2+的最适添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F009图8Mn2+添加量对菌株SD10产纤维素酶活力的影响2.3.4培养条件对菌株SD10产酶活力的影响（见图9~图12）由图9可知，接种量为2.0%时，纤维素酶活力最大，接种量继续增大，纤维素酶活力呈下降趋势，这可能是由于接种量过大发酵快速启动，使菌体数量过多，溶氧不足，菌体无法获得足够的营养，所以生长受到抑制，影响了发酵产物的生成[15]。因此，选择2.0%为发酵培养的接种量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F010图9接种量对菌株SD10产纤维素酶活力的影响由图10可知，菌株SD10在23 ℃培养时纤维素酶活力较高。因此，23 ℃是发酵培养基的最适培养温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F011图10培养温度对菌株SD10产纤维素酶活力的影响由图11可知，摇床转速为200 r/min时纤维素酶活力最高。因此，选择200 r/min作为最佳培养转速。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F012图11转速对菌株SD10产纤维素酶活力的影响由图12可知，随着初始pH值升高，菌株SD10纤维素酶活力逐渐增大，pH值大于8.0时，酶活力开始下降。因此，pH值8.0为发酵培养基的初始pH值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F013图12初始pH值对菌株SD10产纤维素酶活力的影响2.3.5营养条件正交试验结果根据1.2.4.5的试验设计方案做正交试验。粗糙脉孢菌SD10正交试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.T002表2粗糙脉孢菌SD10正交试验结果序号A玉米秸秆B豆粉C Mn2+D空列酶活力/(U/mL)111106.47212205.33313304.77421205.86522305.86623106.60731306.17832106.52933206.44k15.526.176.53k26.115.905.88k36.385.945.60R0.860.270.93由表2可知，3个因素对菌株产酶能力的影响顺序为CAB，即Mn2+添加量玉米秸秆添加量豆粉添加量。粗糙脉孢菌SD10方差分析表见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.T003表3粗糙脉孢菌SD10方差分析表因素离均差平方和自由度均方F值P值A3.4121.7156.600.01B0.3720.196.140.01C4.1122.0668.180.01D1.3420.6722.160.01误差0.54180.03总变异9.7726由表3可知，FCFAFB，即Mn2+添加量（C）影响最大，玉米秸秆添加量（A）次之，豆粉添加量（B）影响最小。最优配方为A3B1C1，即玉米秸秆5%、豆粉1%、Mn2+ 0.2%。根据最优配方培养菌株SD10，测得纤维素酶活力为6.64 U/mL，验证后最优组合为A3B1C1。2.3.6菌株SD10生长曲线的测定菌株SD10在最优培养基和最适发酵条件下的生长曲线见图13。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F014图13菌株SD10在最优培养基和最适发酵条件下的生长曲线由图3可知，菌株SD10的生长时期分为生长迟缓期（0~30 h）、对数生长期（30~60 h）、衰亡期（66 h之后）。在对数生长期菌体数量快速增多，60 h达最大值；进入衰亡期后菌体数量明显下降。菌株SD10产纤维素酶活力随培养时间增加酶活力先增后降，在84 h时达到酶活力达最大值。2.4酶学性质初步研究2.4.1温度对纤维素酶活力的影响（见图14、图15）由图14可知，20~70 ℃时该纤维素酶活力随温度升高先增后降，酶反应的最适温度是50 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F015图14SD10产纤维素酶的最适反应温度由图15可知，40 ℃和50 ℃时该纤维素酶稳定性较好，保温30 min后酶活力仍较高，60 ℃和70 ℃时纤维素酶活力下降明显，说明该纤维素酶适用于中温条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F016图15温度对SD10纤维素酶稳定性的影响2.4.2pH值对纤维素酶活力的影响（见图16、图17）由图16可知，pH值4.0时酶活力达到最高值，pH值大于4.0，酶活力迅速降低，该纤维素酶最适反应pH值为4.0。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F017图16SD10纤维素酶的最适反应pH值由图17可知，该菌所产纤维素酶在酸性环境中的稳定性明显高于碱性环境，在pH值6.0时相对酶活在60%以上，说明SD10纤维素酶属于酸性酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F018图17pH值对SD10纤维素酶稳定性的影响2.4.3金属离子对纤维素酶活力的影响（见图18）以不添加金属离子的纤维素酶活力为100%。由图18可知，金属离子对纤维素酶活力的影响存在明显差异。对纤维素酶有明显激活作用的金属离子是Mn2+，有明显抑制作用的是Fe3+、Zn2+、Cu2+，而Ca2+、Mg2+、K+、Na+的抑制作用不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.016.F019图18金属离子对SD10纤维素酶的影响3讨论研究通过刚果红染色法（水解圈法）和DNS法测定纤维素酶活力，从青藏高原高寒草甸土壤中筛选出一株高产纤维素酶的菌株SD10，菌种进行分子生物学鉴定，鉴定结果为粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）。粗糙脉孢菌具有完整的木质纤维素降解酶系，能够合成多种半纤维素酶、纤维素酶、木质素酶[16]，还能避免由于纤维二糖积累所引起的反馈抑制作用[17]。粗糙脉孢菌不仅具备强大的蛋白质表达和分泌能力，菌体内含丰富的蛋白质、维生素B12和多种酶类，而且具有培养简单，生长迅速[18]，无霉菌毒素生成[19]等优点，可被用与生产发酵。对菌株SD10进行发酵条件优化，最优产纤维素酶条件为：玉米秸秆5%、豆粉1%、Mn2+0.2%、接种量2%、培养温度23 ℃、初始pH值8.0、转速200 r/min。优化后该菌株产纤维素酶活力可达到9.18 U/mL，是优化前的2.6倍。菌株SD10产纤维素酶的最优碳源为玉米秸秆，玉米秸秆作为农业生产副产品，来源广、易获取，利用微生物发酵将秸秆中不易被利用的木质纤维素降解为易吸收的低分子糖，为农作物秸秆生物质能量转化提供一条有效的途径[20-21]。以秸秆为原料通过微生物发酵产生纤维素酶在酿造、饲料添加剂、饮料加工、纺织等领域有很高的应用价值[22]。菌株SD10纤维素酶酶学特性研究的结果表明，该酶反应的最适温度为50 ℃，酶反应的最适pH值为4.0，在pH值5.0~6.0、40~50 ℃时该酶较稳定，金属离子中对酶活力有明显激活作用的是Mn2+，有明显抑制作用的是Fe3+、Zn2+、Cu2+。菌株SD10所产纤维素酶为酸性纤维素酶，酸性纤维素酶应用于青贮饲料生产，能适应青贮的酸性环境，改善饲料营养价值、提高饲料利用率、降低青贮pH值、提高其耐储藏性[23-24]。周正东等[22]从青储饲料中分离出一株产纤维素酶能力较强的丝状真菌粗糙脉孢菌，并进行菌株固态发酵产纤维素酶的条件优化。林标声等[25]对从武平传统“红菌豆腐”中分离的主要发酵菌株粗糙脉孢菌LY03进行分离、鉴定及基因组重测序，分析其基因组变异、功能，有利于揭示红菌豆腐发酵本质，为实现红菌豆腐的工业化生产提供科学依据。4结论研究中粗糙脉孢菌SD10产酸性纤维素酶活力较强，该酶具有良好的pH值稳定性和温度稳定性，且生产成本较低。在后续工作中可通过诱变育种、基因改造、基因克隆等技术手段对菌株SD10进行试验，以进一步提升产酶能力，提高酶的作用效率，为以后的工业生产和应用提供参考。