中药作为一种天然饲料添加剂，具有低毒、功能性强、经济实用、不良反应小等优点。中药材黄芪具有补中益气、泄水消肿、促进肌肉生长等作用[1-2]。黄芪主要活性成分为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素、黄芪甲苷等[3]。基础日粮中添加500 mg/kg和1 000 mg/kg黄芪多糖均能够提高肉仔鸡的屠宰性能和肌肉品质[4]。本实验室研制的复方黄芪饲料添加剂（CAFA）具有提高机体免疫力的作用[5]。以黄芪为组方的饲料可有效促进鸡脾脏的发育、刺激脾淋巴细胞增殖、增加IFN-γ和IL-4细胞因子的分泌和mRNA的表达，提高脾脏淋巴细胞的免疫功能[6]。黄芪有效成分可以改善小鼠巨噬细胞形态、恢复细胞增殖能力、减少机体免疫应激能力。黄芪可调节脾虚湿困大鼠内分泌、免疫系统相关因子进而发挥健脾祛湿功效。黄芪对试验性变态反应性脑脊髓炎小鼠有显著的防治效果，对中枢神经系统的自身免疫反应有显著的抑制效果[7-10]。中药指纹图谱是根据中药材有效成分的差异，运用仪器将不同中药材中的有效成分进行差异性检测的一种分析方法[11]。中药指纹图谱是区分中药材种类、确保药材质量的有效手段。指纹图谱具有整体性、特征性、宏观性和模糊性等特点与中医药传统理论相映射，该方法在中药成分检测领域中有独特优势[12]。黄芪因产地、种类不同，其成分、含量略有差异[13]。多通过色谱法及光谱法建立黄芪指纹图谱，并进行聚类分析以评估产品质量[14-17]。本试验旨在建立CAFA指纹图谱分析方法用来评价黄芪复方饲料添加剂质量。1材料与方法1.1仪器与材料试验仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）、XSELECT® CSHTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）（美国Waters公司）、Waters PDA Detector检测器（美国Waters公司）、HC-2518高速离心机（杭州得聚仪器设备有限公司）、SB-5200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、AX124ZH万分之一分析天平（美国奥豪斯仪器有限公司）。试验试剂：甲醇（色谱纯，批号1812221，GRACE公司）、乙腈（色谱纯，批号9060501，GRACE公司）、甲酸（色谱纯，批号H1913009，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606，中国食品药品检定研究院）、左旋紫草素（批号110769-200506，中国药品生物制品鉴定所）、芒柄花黄素（批号MUST-17031005，成都曼斯特生物科技有限公司）、纯净水（批号4220SJ，杭州娃哈哈集团有限公司）。试验材料：制备10批不同产地黄芪的CAFA冻干粉，不同产地的黄芪由山西中医药大学王兵提供并鉴定，黄芪药材产地见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.T001表1黄芪药材产地样品编号产地样品编号产地1山西武寨6浑源县李家庄黄芪2应县黄芪（三年、三等）7甘肃昌源黄芪3应县黄芪（十年、特等）8吉林汪清县黄芪4内蒙古包头9宁县黄芪5繁峙黄芪10六盘山黄芪1.2试验方法1.2.1建立CAFA的HPLC指纹图谱1.2.1.1色谱条件采用XSELECT® CSHTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），洗脱梯度见表2。流速为0.7 mL/min、进样量10 μL、柱温25 ℃、检测波长为254 nm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.T002表2洗脱梯度时间/min乙腈/%0.15%甲酸水/%059515109045366455554565703067595725951.2.1.2供试品溶液的制备精密称取10个批次适量CAFA冻干粉（11.42 g生药），10批CAFA冻干粉称量见表3。定容至2 mL用甲醇溶液，超声溶解后13 000 r/min离心20 min，过滤膜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.T003表310批CAFA冻干粉称量样品编号重量样品编号重量1503.66509.02503.27506.13507.88505.24501.19501.85506.410506.6mg1.2.1.3对照品溶液的制备精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素和左旋紫草素，分别置于容量瓶中，定容，得到标准品标准储备液。取各标准储备液适量混合制成各成分浓度均为1 mg/mL的混合标准品溶液。1.2.1.4方法学考察精密度试验：取标准品溶液适量，进样6次，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素和左旋紫草素保留时间的RSD值分别为0.17%、0.05%和0.28%，峰面积的RSD值分别为0.18%、1.76%、2.62%。结果表明，试验仪器精密度良好。稳定性试验：取同一供试品溶液，0、2、4、8、12、24 h分别进样，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素和左旋紫草素保留时间的RSD值分别为0.13%、0.98%和0.31%，峰面积的RSD值分别为3.51%、2.84%、4.67%。结果表明供试品24 h内稳定性良好。重复性试验：供试品溶液制备方法处理6份同一批CAFA，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素和左旋紫草素保留时间的RSD值分别为0.15%、0.73%和0.69%，峰面积的RSD值分别为3.45%、2.23%、3.98%。结果表明试验方法重现性较好。线性关系考察：混合标准品溶液按“1.2.1.1”项下色谱条件进样分析，线性分析结果见表4。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素、紫草素3个成分在线性范围内，R0.999，说明线性关系良好，根据标准曲线进行10批CAFA的含量测定，在冻干粉平均含量为：毛蕊异黄酮苷2.658 2 mg/g、左旋紫草素0.824 0 mg/g、芒柄花黄素96.257 7 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.T004表4线性关系考察结果成分回归方程R线性范围/μg毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=710.76x0.999 90.19~9.70芒柄花黄素Y=426.86x-17.5740.999 90.19~9.90紫草素Y=1 254.7x+38.7650.999 90.21~10.601.2.2聚类分析（CA）将10批CAFA样品中共有峰的相对峰面积导入SPSS 26.0软件，利用欧氏距离平方25作为标准对不同批次样品进行聚类分析，S8和S10分为一类，S5、S6、S7、S9、S2、S3、S1和S4分为一类。1.2.3主成分分析（PCA）将指纹图谱中31个共有峰的相对峰面积进行统计，采用SIMCA 14.1进行PCA分析，Scaling为Ctr。构建主成分平面图。2结果与分析2.1不同批次CAFA指纹图谱的分析对10批样品进行检测得到色谱图，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012版本）”。以S1样品色谱图作为参照，选择中位数法生成对照指纹图谱，多点校正计算，并经过谱峰匹配得出CAFA指纹图谱，确定31个共有峰，CAFA指纹图谱与CAFA对照指纹图谱分别见图1、图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F001图1CAFA指纹图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F002图2CAFA对照指纹图谱取各标准品储备液适量，进样检测并记录色谱图，通过单一对照品以及混合对照品确定共同的色谱峰，经对照品指认，最终确定了这3个色谱峰分别为；16号毛蕊异黄酮葡萄糖苷、29号芒柄花黄素和31号左旋紫草素。毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品色谱图、芒柄花黄素标准品色谱图、左旋紫草素标准品色谱图、混合标准品色谱图分别见图3~图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F003图3毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F004图4芒柄花黄素标准品色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F005图5左旋紫草素标准品色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F006图6混合标准品色谱图2.2不同批次CAFA指纹图谱相似度评价（见表5）由表5可知，不同来源的CAFA之间相似度大于0.9，说明不同批次CAFA较一致。其中2号、3号、4号、5号和6号相似度都在0.97以上，表明同一产地黄芪药材相似度良好。内蒙古包头与山西北部接壤，因此山西各县黄芪与内蒙古包头黄芪相似，5号以繁峙黄芪为君药的CAFA相似度最高。7号、8号、9号和10号黄芪药材因与山西地域相差太大，其相似度较小，表明黄芪药材因地域不同其质量有所差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.T005表5不同批次CAFA指纹图谱相似度评价样品编号相似度样品编号相似度S10.922S60.976S20.971S70.936S30.974S80.934S40.974S90.923S50.977S100.9582.3不同批次CAFA的CA图（见图7）由图7可知，不同批次CAFA之间整体上一致性较好。由于产地不同，样品之间质量有所差异。2号和3号同以应县黄芪为君药的CAFA，经聚类分析以及相似度综合评价表明质量稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F007图7不同批次CAFA的CA图2.4不同批次CAFA的PCA散点得分（见图8）由图8可知，样品S8、S10和S3、S7、S5、S6、S2、S4、S1出现明显分类，与聚类分析结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.024.F008图8不同批次CAFA的PCA散点得分3讨论本试验中，高效液相色谱法建立的CAFA指纹图谱分析出31个共有峰，对照品所指认的化学成分中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花黄素属于异黄酮类物质。CAFA中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、左旋紫草素以及芒柄花黄素均为提高机体免疫力的活性成分。经相似度分析发现，不同批次CAFA之间相似度均大于0.9，说明不同批次之间整体上一致性较好，但由于地域不同其质量存在差异。4结论研究采用指纹图谱相似度评价方法结合化学模式识别技术对10批CAFA进行质量研究，通过聚类分析将CAFA样品分为两类，聚类结果基本符合相似度评价以及主成分分析结果。该技术可以用于中药复杂成分的指纹图谱建立，并进行较全面的分析和评价，快速确定不同批次的药物及其关键成分的质量，从而为鉴定和分析CAFA的有效成分提供丰富而准确的信息。