五氯酚酸钠是一种氯代烃类农药[1]，可被用作抗菌剂、防腐剂和杀螺剂[2-4]。因为杀虫效果好且具有成本低的优势[5]，得到广泛使用[6]。但五氯酚化学稳定性好，不易分解，大量使用容易对环境造成污染，尤其是在水产养殖及种植环节的过度使用容易导致水体、土壤受到污染。五氯酚通过环境蓄积进入养殖饲料中[7-8]，会造成一定程度的食品安全风险。近年来，市场监督及农业农村管理部门对畜禽产品中五氯酚残留情况持续关注[9]，养殖企业也开始重点关注五氯酚污染残留的风险。为控制五氯酚残留，保证食品安全，需要从饮用水、土壤、饲料、畜禽产品等环节[10-11]进行全链条的风险监测。饲料作为畜禽养殖生产中最重要的投入品，保证饲料的食品安全尤为重要。但目前检测五氯酚的方法多局限于纺织品、皮革、水体和畜禽产品[12-14]，对饲料的检测方法涉及较少[15-16]。因此，建立适用于动物饲料五氯酚含量的检测分析方法，对于生产企业在养殖生产环节控制动物食品中五氯酚的残留风险、保障消费者饮食安全意义重大。1材料与方法1.1材料与试剂五氯酚钠（纯度94.5%），甲醇、乙腈（质谱纯，TEDIA），甲酸（色谱纯，aladdin），三乙胺（色谱纯，aladdin），乙酸铵、氨水（分析纯，kermel），Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，Waters）。1.2仪器设备1290 Infinity Ⅱ-G6470A超高效液相色谱－串联质谱仪（美国安捷伦公司），配电喷雾离子源、MS105DU电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司），高速离心机（湘仪仪器有限公司），UMV-2多管混匀仪（杰博森仪器有限公司），固相萃取真空装置（上海靳澜仪器制造有限公司），HM6300全自动智能均质仪（莱普科技有限公司），UC-4035超声波清洗机（深圳市朗杰超声电器有限公司），NGB1024水浴式氮吹仪（莱普科技有限公司）。1.3标准溶液配制精密称量0.001 0 g（精确至0.000 1 g）的五氯酚标准品于100 mL容量瓶中，采用甲醇溶解，并定容作为标准储备液。从中吸取0.1 mL储备液于50 mL容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，配成20 μg/L的标准工作液用于测试分析。准确量取0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL标准工作溶液于10 mL容量瓶，采用流动相定容至刻度，配成浓度依次为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的标准溶液，过滤后上机测定绘制标准曲线。1.4试剂配制5%三乙胺-乙腈-水溶液：在500 mL容量瓶中加入25 mL三乙胺，采用V乙腈∶V水=7∶3的混合溶液定容混匀。4%甲酸-甲醇溶液：在500 mL容量瓶中加入20 mL甲酸，采用甲醇定容混匀。2%甲酸-甲醇-水溶液：用量筒分别量取250 mL 4%甲酸－甲醇溶液和水于500 mL烧杯中搅拌混匀。0.1%甲酸-水溶液：准确量取1 mL甲酸至1 000 mL容量瓶，采用水定容至刻度，混合均匀。乙腈-0.1%甲酸水溶液（90∶10）：准确量取90 mL乙腈和10 mL 0.1%甲酸-水溶液，混合均匀。1.5试验方法1.5.1样品制备与保存取具有代表性的饲料样品至少200 g，粉碎过筛（1 mm孔径）待测。1.5.2提取和净化称取试样2.0 g，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL 5%三乙胺-乙腈-水溶液。涡旋仪混合30 s，于多管混匀仪振荡5 min，超声提取5 min，3 000 r/min离心5 min。离心后，将上清液全部转移至另一洁净离心管中。离心管底部剩余残渣再次使用10 mL 5%三乙胺－乙腈－水溶液重复上述步骤提取1次。将2次提取的上清液合并混匀。将所得提取液转入MAX固相萃取柱中，以约3 mL/min的流速过柱，弃去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL甲醇、5 mL 2%甲酸-甲醇-水溶液对固相萃取柱进行淋洗，弃去流出液，用真空泵抽干。以4 mL 4%甲酸-甲醇溶液进行洗脱，洗脱液用干净的10 mL具刻度试管收集，在40 ℃水浴条件下氮吹浓缩至1 mL，使用水定容至2 mL混匀，过膜待测。1.5.3色谱条件色谱柱：C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm），柱温：30 ℃，流动相：乙腈+0.1%甲酸水（90∶10），流速：0.30 mL/min，进样量：2.00 μL，运行时间2.5 min。1.5.4质谱条件离子源：电喷雾离子源，扫描方式：负离子扫描，检测方式：多重反应监测（MRM），定性离子对、定量离子对、驻留时间、碎裂电压及碰撞能量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T001表1五氯酚检测的质谱参数项目母离子子离子驻留时间碎裂电压/V碰撞能量/V五氯酚262.7262.7*1201231264.7264.71201282266.7266.71201221268.7268.71201201注：“*”为定量离子。2结果与分析2.1前处理条件优化选取5%三乙胺-乙腈-水溶液作为样品提取液，针对样品提取液体积进行试验优化。试验称取空白饲料样品2 g，加标量为2 μg/kg，分析采用6 mL和10 mL提取液2次重复提取对检测回收率的影响，试验结果见表2。由表2可知，采用10 mL提取液进行2次重复提取，相较于6 mL提取，最终平均回收率高22.3%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T002表2不同提取体积对五氯酚提取率的影响提取体积/mL称样量/g加标量/(μg/kg)测定浓度/(μg/kg)回收率/%平均回收率/%6221.4472.074.56221.5376.66221.5074.910221.9597.496.810221.9094.810221.9698.22.2色谱条件优化选择C18（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）作为试验色谱柱，使用浓度为100 μg/L的五氯酚标准溶液进行测试分析。对比乙腈-0.1%甲酸水（90∶10）和甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液两种流动相试验结果，梯度洗脱条件见表3，发现流动相采用甲醇-5 mmol/L乙酸铵水流动相试验，目标峰出峰时间较长，且附近有杂峰（见图1）；采用乙腈-0.1%甲酸水进行试验，目标峰出峰时间短，且附近无杂峰（见图2）。因此，选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T003表3梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0406011000410005406010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.F001图1五氯酚标准溶液色谱（乙腈-0.1%甲酸水流动相）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.F002图2五氯酚标准溶液色谱（甲醇-5 mmol/L乙酸铵水流动相）2.3线性方程、检出限及定量限配制为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的系列标准溶液，按照试验条件进行测定，以五氯酚的峰面积和样液浓度分别作为纵坐标和横坐标绘制标准曲线。结果表明，在0.5~20 μg/L范围内五氯酚检测线性良好，Y=125.28X+652.12，相关系数R2=0.999 1（见图3）。取空白饲料样品，添加1、2、5、10、20 μg/kg样品进行试验分析，以3倍信噪比（S/N=3）计算分析方法的检出限，10倍信噪比（S/N=10）计算定量限。结果显示，饲料中五氯酚的检出限为1 μg/kg，定量限为2 μg/kg（见表4）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.F003图3五氯酚标准曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T004表4检出限和定量限分析结果空白样品峰面积含量/(μg/kg)添加水平/(μg/kg)回收率/%信噪比Y1-1953.831.151.0114.87.7Y1-2914.431.081.0107.97.2Y2-11 140.001.982.099.216.4Y2-21 127.061.882.094.116.7Y3-11 650.904.045.080.774.6Y3-21 625.893.945.078.760.2Y4-12 408.897.3810.073.8121.1Y4-22 390.977.0110.070.1144.0Y5-14 410.9816.1020.080.5277.5Y5-24 232.6715.3920.076.9278.42.4回收率及精密度取空白饲料样品进行加标回收试验，分别添加浓度为1、2、5、10、20 μg/kg的样品，每个添加浓度水平做6个重复，样品经提取净化后上机测试分析。结果显示，该方法的平均回收率在72.4%~109.6%之间，相对标准偏差（RSD）为3.37%~6.24%（见表5），满足饲料中五氯酚的检测分析要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T005表5五氯酚平均回收率和相对标准偏差（n=6）添加水平/(μg/kg)平均回收率/%RSD/%1109.63.37299.25.73584.56.241072.45.632075.84.892.5稳定性取加标浓度为20 μg/kg的饲料样品进行稳定性试验测试，样品的预处理及提取净化步骤均按照本方法执行，最终样品供试溶液分别在0、12、24、48、74 h时进行测定分析。对比试验结果显示，该样品在12 h内峰面积无明显变化，12 h之后随时间增加，峰面积逐渐降低（见表6），因此处理完毕的饲料样品应在12 h内检测完毕，避免因样品内五氯酚酸钠含量降低，导致结果失真。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T006表6稳定性测试结果放置时间/h样品峰面积平均峰面积RSD/%0平行14 410.984 373.222.88平行24 232.67平行34 476.0012平行14 393.124 315.211.83平行24 317.32平行34 235.1924平行14 112.304 014.902.54平行23 909.21平行34 023.1048平行13 978.413 874.642.40平行23 798.32平行33 847.1972平行13 812.293 727.982.15平行23 653.21平行33 718.512.6实际样品测定结果（见表7）为验证本方法在实际测样过程中的情况，特选取某2个养殖场为调研对象。在养殖场及配套饲料厂进行饲料样品取样监测。样品类型覆盖饲料添加剂、饲料原料、配合饲料三种类型共19份样品，针对这些样品进行了测试分析。由表7可知，上述样品均未检出五氯酚。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.023.T007表7实际样品测定结果样品名称检测结果检出限定量限饲料添加剂1未检出1.02.0饲料添加剂2未检出1.02.0饲料添加剂3未检出1.02.0饲料添加剂4未检出1.02.0膨化大豆未检出1.02.0麸皮未检出1.02.0豆粕未检出1.02.0玉米未检出1.02.0稻谷未检出1.02.0高粱未检出1.02.0小麦未检出1.02.0配合饲料1未检出1.02.0配合饲料2未检出1.02.0配合饲料3未检出1.02.0配合饲料4未检出1.02.0配合饲料5未检出1.02.0配合饲料6未检出1.02.0配合饲料7未检出1.02.0配合饲料8未检出1.02.0μg/L万译文等[17]测定了长沙市周边待售渔业饲料，有3份五氯酚检出值在0.64~1.22 μg/L。田志梅等[18]在广州周边饲料店共抽取了50份饲料及饲料添加剂样品，检测发现3份样品五氯酚检出值在6.02~7.79 μg/kg。何正和等[19]在淮安地区抽检14份饲料样品检测，其中发现1份鱼饲料样品中有五氯酚检出，但未达到定量限，表明五氯酚对饲料有一定的污染。本研究实际样品测定中，虽然均未检出五氯酚，但并不能排除风险，下一步需要扩大取样区域范围及增加样本量，对养殖各环节中饲料质量进行持续监测，确保市场在用饲料质量安全，保证食品安全。3讨论五氯酚及其钠盐的检测方法主要包括气相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-三重四极杆质谱法[20]、液相色谱、超高效液相色谱-串联质谱法[21-22]。其中超高效液相色谱-串联质谱法因定量准确、灵敏度高等优点被广大科研工作者所喜爱，广泛应用于各领域检测分析研究工作[23-24]。因此，本试验采用超高效液相色谱-串联质谱法进行测定分析。五氯酚属于弱酸性物质，易溶于有机溶剂，而五氯酚酸钠易溶于水[25-26]。在实际测定分析过程中，通常选择弱酸性有机溶液或弱碱性有机溶液两种提取体系对样品中的五氯酚及五氯酚酸钠进行提取[27]。常用的有机溶剂提取液主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等，以盐酸溶液、甲酸溶液等提供弱酸性条件，氨水溶液、三乙胺溶液等提供碱性条件。孙金影等[27]对比分析了乙腈-1%甲酸溶液（80∶20）和乙腈-5%三乙胺溶液（80∶20）对样品中五氯酚酸钠的提取效果，发现2种提取溶剂提取效率无显著差异。兰红军等[28]研究了100%丙酮、100%乙腈和酸化后的乙酸乙酯-正己烷（20∶80）3种提取液对五氯酚的提取效果，发现100%乙腈提取效果最差，只有51%，酸化的乙酸乙酯-正己烷提取效率最好，高达93%。陆阳等[26]对比了100%乙腈、100%甲醇、乙腈-0.5%甲酸、甲醇-0.5%甲酸溶液对五氯酚的提取效率，发现酸化的乙腈和甲醇提取效率明显优于纯有机试剂。由于乙酸乙酯气味较浓烈，不建议使用，而乙腈黏度低，有沉淀样品溶液中蛋白的作用，因此有机溶液选择乙腈。在GB 23200.92—2016中，采用乙腈-三乙胺提取液的效果较好，所以本研究选择了乙腈-三乙胺作为本次试验提取体系。对于净化方式的选择，目前试验研究中主要有固相萃取法、QuEChERS法、硫酸磺化法[29-30]。QuEChERS法多用于动物源性食品、血液及尿液测定分析的净化处理，操作简单、检测效率高、成本较低，但前期试验需要进行分散剂的选择和配比优化，工作量较大。硫酸磺化法操作简单，通常用于气相色谱测定法使用，净化效果一般。因此，本试验采用净化效果较好的固相萃取柱进行提取液的净化处理。通过试验分析该方法在0.5~20.0 μg/L浓度内呈良好的线性关系（R2=0.999 1），加标浓度在1~20 μg/L范围时，平均回收率在72.4%~109.6%之间，相对标准偏差（RSD)为3.37%~6.24%。可以满足饲料中五氯酚含量的定量测定分析。4结论本研究建立了饲料中五氯酚含量的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，试验针对样品不同的提取液体积及提取次数进行了对比分析，优化了色谱条件及样品提取过程。通过对以上各参数的优化和确定，实现了对饲料中五氯酚含量的定量分析。本方法检测重复性好、准确率及稳定性高，适用于大批量饲料中五氯酚含量的测定分析。