微生态制剂作为一种高效、绿色的饲料添加剂，具有调节动物肠道菌群、提高机体免疫力和改善生产性能等作用，是重要的抗生素替代品[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, BS）广泛存在于土壤、植物体表和动物肠道中，无残留、安全性高，是农业农村部批准使用的微生态制剂。枯草芽孢杆菌能够形成内生孢子，具有耐高温、耐酸碱、耐挤压的特性，因此枯草芽孢杆菌成为应用最广泛的益生菌之一。研究表明，枯草芽孢杆菌具有提高家禽生长性能、维护肠道屏障、调控细胞因子分泌、稳定肠道菌群、改善抗氧化能力等生理功能[2-4]。本文综述了枯草芽孢杆菌在肉鸡生产中的应用及作用机制，为其在肉鸡生产中的进一步应用提供参考。1枯草芽孢杆菌概述枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的好氧（或兼性厌氧）、革兰氏阳性菌，长2.0~3.0 μm，直径0.6~1.0 μm，可以产生内生芽孢，具有单层细胞外膜、有鞭毛、能够运动、无荚膜[5]。作为一种产孢子好氧菌，枯草芽孢杆菌具有很强的耐热性，在100 °C的高温下仍可存活[6]。同时，枯草芽孢杆菌孢子具有较强的抗逆性，能够在低pH值和胆盐等胃肠道环境中萌发[7]。这意味着枯草芽孢杆菌在肉鸡消化道前端进入孢子休眠期，而在温度、营养充足且有氧的消化道后段进入生长期，恢复生理活动。枯草芽孢杆菌稳定性强，在促进动物生长发育、维持动物机体健康等方面均具有积极作用。研究发现，枯草芽孢杆菌产生的细胞外酶具有提高饲料消化利用率、改善肠道环境、增强免疫力、促进动物的生长等生理功能[8-10]。2枯草芽孢杆菌的作用机制2.1提高生产性能研究发现，枯草芽孢杆菌本身会分泌蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等消化酶，能够提高肉鸡肠道脂肪酶和蛋白酶活性，改善肉鸡对营养物质的消化能力[11-12]。此外，根据枯草芽孢杆菌分泌消化酶的特性，可将其应用于发酵蛋白质原料中，提高可溶性蛋白和总氨基酸含量，降低植酸、大豆抗原等抗营养因子含量，提高饲料消化率[13-14]。另一方面，枯草芽孢杆菌能够通过提高小肠的绒毛高度、绒隐比改善肠道消化吸收能力[15-16]。此外，枯草芽孢杆菌还能够增加盲肠中乳杆菌、粪杆菌、黄酮分解菌和氢厌氧菌等菌群的丰度[2]。枯草芽孢杆菌还可以激活胆汁酸膜受体（TGR5），通过调节胆汁酸代谢，促进5羟色胺分泌调节肠蠕动，这也可能是生产性能提高的原因之一[17]。2.2提高抗病力2.2.1维持肠道上皮屏障肠道形态和肠黏膜上的紧密连接蛋白是维持上皮屏障的完整性和调节细胞旁通透性的关键。枯草芽孢杆菌通过上调胰岛素样生长因子-1受体、小肠表皮细胞生长因子等mRNA的表达，促进小肠绒毛发育，改善肠道绒毛高度、隐窝深度及绒隐比来维持正常肉鸡和改善病鸡的肠道形态[18]。枯草芽孢杆菌通过上调肠黏膜紧密连接蛋白-1（zona occludens protein-1，ZO-1）、紧密连接蛋白（Occludin）、连接黏附分子2（junctional adhesion molecule2，JAM2）维持及调节肠道通透性；通过抑制Notch通路并激活Atoh1表达来增加GCs数量，使黏蛋白基因MUC2表达上调，维持肠道表面黏液层结构并阻止微生物接近最内层黏液层[19-21]。分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，sIgA）是肠黏膜表面最显著的抗体，提供被动的免疫保护以抵御入侵的病原体，枯草芽孢杆菌诱导小肠IgA分泌细胞增殖分化，促进sIgA的分泌，刺激体液免疫系统产生更多的抗体，从而增加的抗体覆盖肠黏膜表面，保护绒毛不受损伤[22]。研究发现，枯草芽孢杆菌以生物膜的形式覆盖在肠道黏膜表面，提高肠黏膜的物理阻力，降低外力对肠道的损伤[23]。2.2.2调控细胞因子分泌肠道黏膜上的Toll样受体（toll-like receptor，TLR）是启动免疫应答的初始信号传导工具，枯草芽孢杆菌的潜在信号通路来源于TLR2的识别和随后对髓样分化因子MyD88的递呈，使核因子κB抑制蛋白（IκB）磷酸化激活核因子κB（NF-κB），上调β防御素1的表达[24]。枯草芽孢杆菌BN菌株通过TLR2信号的激活还会诱导辅助性T细胞1（helper 1 cell，Th1）型细胞因子的释放、巨噬细胞和树突状细胞的成熟以及Th1细胞的增殖和分化[25]。在动物机体开始发生炎症时，被激活的巨噬细胞分泌促炎细胞因子，如细胞白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、干扰素-γ（interferon γ，IFN-γ）和白细胞介素12（interleukin-12，IL-12）。IL-6既是促炎因子又是抗炎因子，也是未成熟B细胞向分泌IgA细胞分化所必需的。当炎症严重时，促炎细胞因子的过度激活和分泌导致细胞破坏和死亡，此时巨噬细胞又会分泌抗炎细胞因子IL-10启动辅助性T细胞2（helper 2 cell，Th2）相关保护性免疫反应的形成，而Th2相关的细胞因子抑制了IL-12的合成，导致Th2细胞来抑制炎症。枯草芽孢杆菌与巨噬细胞共同培养时，细胞中IL-1β和TNF-α的含量明显上升；而在与感染白色念珠菌的小鼠单核共培养时，巨噬细胞中白色念珠菌感染诱导的细胞因子发生改变，抗炎细胞因子IL-10上调，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-6下调，表明枯草芽孢杆菌可以平衡Th1和Th2的细胞反应，维持免疫稳态[26]。2.2.3稳定肠道菌群枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道菌群的影响主要体现在促进有益菌生长并抑制有害菌生长。枯草芽孢杆菌不影响肠道微生物多样性，且厚壁菌门和拟杆菌门等肉鸡肠道中主要菌门的相对比例变化也较小[27]。拟杆菌门的大多数成员有助于促进肠道消化，促进底物在后肠发酵，产生短链脂肪酸，降低肠道pH值，从而限制有害微生物繁殖[28]。另外，乳酸菌和双歧杆菌等厌氧菌属的增加及枯草芽孢杆菌的生长能够消耗肠道内的氧气，抑制沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌的生长[29-30]。研究发现，枯草芽孢杆菌可以阻断金黄色葡萄球菌的Agr群体感应系统，从而抑制细菌的增殖，调控肠道菌群平衡[31]。而肠道微生物群又能够通过调节微生物群-肠道-脑轴来减轻动物的炎症反应并减少应激诱导的行为[32]。2.3改善肉品质枯草芽孢杆菌可能通过提高抗氧化能力和调控脂肪合成来改善肉品质。枯草芽孢杆菌可通过激活Nrf2核转录因子（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）而上调血红素加氧酶（heme oxygenase 1，HO-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化酶基因表达，提高SOD酶活性，促进超氧阴离子自由基（·O2-）生成O2和H2O2，然后通过CAT和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）分解为水，从而通过抑制活性氧、羟自由基8-羟基脱氧鸟苷、脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羰自由基的形成以及降低线粒体膜电位来抑制机体氧化损伤[2,9]。此外，枯草芽孢杆菌通过上调鸡肉在贮藏期的Nrf2、HO-1、SOD、CAT、GSH-Px及线粒体中禽解偶联蛋白、线粒体转录因子A和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α的mRNA表达水平来提高鸡肉在4 ℃贮藏8 d后的自由基清除能力和抗氧化活性，从而改善肉色[33]。枯草芽孢杆菌下调猪脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶等脂肪合成关键基因mRNA的表达，降低脂肪合成关键酶的生成，调节脂质代谢，从而影响肉品质[34]，但在肉鸡的研究中还缺乏相关佐证。3枯草芽孢杆菌在肉鸡生产中的应用3.1枯草芽孢杆菌对生长性能的影响经过长期的育种筛选，肉鸡的生产性能已经得到很大的提高，而在饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够进一步提升肉鸡的生产性能[19,35]。Jayaraman等[15]在肉鸡饲粮中添加5×1011 CFU/kg枯草芽孢杆菌PB6，提高了肉鸡采食量，饲料转化率（feed conversion ratio，FCR）提高了8%。Rhayat等[36]研究发现，使用添加枯草芽孢杆菌DSM29784菌株的饲粮饲喂肉鸡，FCR和肉鸡的平均体重分别提高了3.8%和3.2%。Goodarzi等[37]研究发现，在肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌，提高了肉鸡对粗蛋白、淀粉和能量的消化率，并改善了生长期肉仔鸡的粪便评分。研究发现，饲粮中添加1×1010 CFU/kg枯草芽孢杆菌，肉鸡2 w内日增重比对照组提高27.7%，饲料转化率提高103%[38]。Nguyen等[39]从鸡胃肠道分离出7株芽孢杆菌菌株，发现CH16菌株在改善生长性能方面效果最佳，添加3.0×106 CFU/g CH16使肉鸡平均日增重增加9.17%，饲料转化率提高9.79%。此外，枯草芽孢杆菌可以和亚硒酸钠[40]、果糖[41]、丝兰提取物[42]、丁酸梭菌[43]等联合使用，促进肉鸡生长。Chen等[44]研究发现，使用3 g/kg枯草芽孢杆菌发酵产品（菌浓度2×1013 CFU/kg，表面活性物质浓度为1.05 mg/g）饲喂肉鸡，能够改善由脂多糖引起的生产性能下降。杨敏敏等[45]研究发现，5×1012 CFU/kg枯草芽孢杆菌具有同样的效果。Rivera等[46]研究表明，日粮中添加亚甲基二硅酸杆菌肽（bacitracin methylene disalicylate，BMD）能够使肉鸡体重提高4%，100 g/t枯草芽孢杆菌可以有效替代BMD，改善微生物群和肠道结构，产生与BMD一致的效果。3.2枯草芽孢杆菌对抗病力的影响在肉鸡饲养过程中，热应激、腹泻等严重影响生产效益，研究中常以模拟疾病感染模型来验证枯草芽孢杆菌的防控效果。Liu等[47]研究发现，将枯草芽孢杆菌PB6加入感染产气荚膜梭菌的肉鸡饲粮中，降低了感染肉雏鸡的病变评分，增加了Occludin基因和ZO-1基因的表达，降低了TNF-α基因的表达。Whelan等[27]、Sokale等[48]和Ma等[49]研究发现，饲粮添加枯草芽孢杆菌DSM 32315能够降低肉鸡坏死性肠炎的病死率，降低肠炎对生产性能的造成的负面影响，维护肠道结构完整性，并稳定肠道微生物群结构，降低Ruminococcus spp.等与炎症相关的菌群数量，防止空肠弯曲菌、大肠杆菌和各种沙门氏菌等机会性致病菌引起的肠道疾病。饲粮添加枯草芽孢杆菌29784也能够在肉鸡坏死性肠炎时上调肠道编码紧密连接蛋白密封蛋白（claudin，CLDN1）、JAM2、紧密连接蛋白（tight junction protein 1，TJP1）、IL-12、IFN-γ、转化生长因子-β和TLR5、TLR21基因表达，使免疫功能和肠道完整性增强[50]。Xing等[35]研究表明，雏鸡饲粮添加枯草芽孢杆菌BSH能够减轻沙门氏菌感染雏鸡肝脏的病理变化，降低沙门氏菌对肝脏和脾脏的侵袭，感染雏鸡存活率提升34%，并促进唾液乳杆菌在鸡盲肠中的增殖。3.3枯草芽孢杆菌对肉品质的影响枯草芽孢杆菌可通过改善肉色、系水力、pH值、滴水损失、蒸煮损失等指标来改善肉品质。Mohammed等[51]研究指出，饲粮添加0.5 g/kg枯草芽孢杆菌能够提高腿肌亮度和系水力，降低蒸煮损失。Cramer等[10]研究发现，饲粮添加1×109 CFU/kg枯草芽孢杆菌能够通过影响肉仔鸡宰后糖酵解代谢速率来缓解肉仔鸡胸肌pH值的下降，并在不影响肉质特性的前提下提高肉仔鸡的胸肌重量，减轻热应激下肉仔鸡胸肌的氧化损伤。Bai等[33]研究发现，饲粮添加1.0×1011 CFU/g枯草芽孢杆菌可以使贮藏8 d时的肌肉pH值显著提高，滴水损失、蒸煮损失及剪切力数值显著降低，并改善肉色。1.0×109 CFU/kg枯草芽孢杆菌亦可显著提高肉鸡胸肌亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）[52]。Yang等[53]在饲料中添加29.17 μg/g有机铬和1.0×109 CFU/g枯草芽孢杆菌增加了鸡胸肉的L*、a*和b*，降低了胸肌的剪切力和蒸煮损失，并提高了胸肌的保水能力。4展望枯草芽孢杆菌能够适应饲料生产及肉鸡胃肠道等不利的生长环境，但不能在肠道中定植。枯草芽孢杆菌可作为替抗添加剂应用于肉鸡生产中，具有提高肉鸡生长性能和抗病能力、改善肉品质等作用。除了对菌株的筛选、发酵及组合相关研究，有学者将枯草芽孢杆菌进行基因重组或部分敲除作为疫苗载体等，拓展了枯草芽孢杆菌的使用方向。目前，对于枯草芽孢杆菌的菌株及剂量还未有具体的应用标准，菌株来源及前处理导致的功效、机理的差异研究不够完善，与微量元素、益生元等其他添加剂的协同或拮抗作用机制尚不明确。菌株来源、添加剂量及时长、动物生长阶段等均会对枯草芽孢杆菌的应用效果产生影响，而相关应用标准的制定也存在一定的困难。不同菌株的生理功能及生物活性不同，造成菌株产品的选用和量化生产受阻。枯草芽孢杆菌促生长的功能是否会导致肉鸡肌肉和骨骼发育失调，其代谢副产物是否会刺激致病菌产生耐药性，以及枯草芽孢杆菌在促炎和抗炎反应中的偏向性，均有待进一步研究。未来，应该针对枯草芽孢杆菌及组合的作用方式、作用机制及应用标准展开更系统的研究，以便将其更好地应用于肉鸡生产，从而推动行业发展。