豆粕蛋白含量较高，营养丰富，富含各种必需氨基酸[1-2]，是一种优质的植物蛋白源，广泛应用于禽畜、渔业养殖领域[3]。但豆粕中大分子物质的消化率和生物学效价较低。研究表明，益生菌发酵豆粕是一种有效平衡饲料营养结构的方法[4]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是允许在饲料中添加的微生物[5]，抗逆性强，生长速度快，能够快速分泌大量蛋白质及代谢物，不产生毒素，是一种安全的发酵微生物[6]。枯草芽孢杆菌能把豆粕中大分子蛋白质降解为小分子蛋白质和小肽[7]，增加游离氨基酸含量，同时去除豆粕中抗营养因子。酸溶蛋白、粗蛋白、游离氨基酸和肽含量是饲料品质的重要指标，常被用于评估原料深加工的程度[8-9]。枯草芽孢杆菌虽然能够有效改善豆粕营养价值，但不同发酵工艺对品质的影响存在很大差异[10]。豆粕含有的抗营养因子限制了其在动物生产中的应用。豆粕中的抗原蛋白主要有大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白，其分子量较大，动物无法直接吸收利用，会导致幼龄动物产生过敏现象[11]。胰蛋白酶抑制剂会抑制动物体内胰蛋白酶活性，妨碍蛋白质消化，造成氨基酸代谢失衡[12]。棉籽糖和水苏糖是非还原性功能低聚糖，无法消化吸收[13]。脲酶是一种含镍元素的寡聚酶，会降低机体对氮的利用[14]。王园等[15]研究表明，采用枯草芽孢杆菌发酵豆粕后，其中的胰蛋白酶抑制剂基本降解，大豆抗原蛋白含量降低。基于此，本试验研究了枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕的工艺参数，比较分析了最佳发酵条件下，发酵对豆粕中营养成分含量的影响，以期为发酵豆粕的实际生产提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1试验材料豆粕购自吉林出彩农业产品开发有限公司；枯草芽孢杆菌由吉林省农业科学院分离鉴定，保藏于-80 ℃；化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司；ELISA检测试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司。1.1.2试验仪器HZQ-Q全温振荡培养箱购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，MLS-3780高压蒸汽灭菌锅购自日本Sanyo公司，XSP-2C生物显微镜购自日本Olympus公司，KjeltecTM 2300凯氏定氮仪购自福斯分析仪器公司，L-3000全自动氨基酸分析仪购自日本日立公司，IC-KZ3TP-22匀浆仪购自上海迈克孚生物科技有限公司，LC-18高效液相色谱仪购自美国Waters公司，GC-9870气相色谱仪购自武汉菲谱光电技术有限公司，ELx800全自动酶标仪购自美国BioTek公司。1.2试验设计及检测方法1.2.1枯草芽孢杆菌发酵豆粕的制备粉碎豆粕过40目筛后置于60 ℃恒温烘箱中至恒重，取出干燥豆粕分装于无菌自封袋中。向豆粕原料中添加枯草芽孢杆菌菌液（活菌数≥3.16×1010 CFU/mL），充分搅拌后，放入恒温培养箱37 ℃进行发酵。发酵结束后，将发酵豆粕于60 ℃恒温烘箱中烘干至恒重，用于后续试验。1.2.2单因素试验设计按梯度设置依次进行发酵，研究发酵温度（31、34、37、40、43 ℃）、接种量（9%、12%、15%、18%、21%）、发酵时间（24、48、72、96、120 h）、液料比（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL/g）对酸溶蛋白含量的影响，每个样品进行3次重复试验取平均值。1.2.3响应面试验设计结合单因素试验的结果，使用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken选取发酵时间、菌液接种量和液料比进行响应面优化试验，以酸溶蛋白含量为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验。枯草芽孢杆菌Box-Behnken试验因素水平设计见表1。对试验结果进行方差分析和二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，分析各因素之间的效应，最后在一定范围内得出最优解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.T001表1Box-Behnken试验因素水平设计水平A接种量/%B发酵时间/hC液料比/(mL/g)-19240.4012480.6115720.81.2.4酸溶蛋白含量测定根据肖志明等[16]的试验方法处理样品，参考GB/T 22492—2008，采用凯氏定氮法测定酸溶蛋白含量。1.2.5营养成分含量测定在枯草芽孢杆菌优化后的发酵工艺参数条件下发酵豆粕，与原料豆粕的营养物质含量进行比较分析。粗蛋白、粗灰分、游离氨基酸、肽、棉籽糖、水苏糖的含量和脲酶活性分别参考国标方法测定（GB/T 6432—2018、GB/T 6438—2007、GB/T 18246—2019、GB/T 22492—2008、GB/T 22491—2008、GB/T 8622—2006）。胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量采用酶联免疫ELISA分析试剂盒进行测定。1.3数据统计与分析数据使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较，P0.05表示差异显著。采用Origin 2022进行绘图，响应面试验设计使用Dx-8处理。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1发酵温度对豆粕酸溶蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，随着发酵温度增加，酸溶蛋白含量呈先增加后降低的趋势。在37 ℃时达到最大值11.58%后，酸溶蛋白含量随温度增加逐渐下降。因此，选择37 ℃为最佳发酵温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F001图1发酵温度对豆粕酸溶蛋白含量的影响2.1.2接种量对豆粕酸溶蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，豆粕的酸溶蛋白含量随枯草芽孢杆菌接种量的增加而增加，在接种量12%时达到最大值12.57%后，随着接种量继续增加而逐渐降低。在低接种量时，枯草芽孢杆菌需要很长时间生长，发酵豆粕中的酸溶蛋白含量较低；在高接种量时，大量的枯草芽孢杆菌生长发育造成豆粕的营养物质和空气不足以支撑其消耗，导致酸溶蛋白含量降低。因此，枯草芽孢杆菌发酵豆粕的后续响应面试验的接种量选择12%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F002图2接种量对豆粕酸溶蛋白含量的影响2.1.3液料比对豆粕酸溶蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，随着液料比的增加，枯草芽孢杆菌发酵豆粕中酸溶蛋白的含量增加，在液料比0.6 mL/g时达到最大值12.47%，之后随着水分增加酸溶蛋白含量逐渐降低。水分是固态发酵中十分重要的因素，水分过低无法满足枯草芽孢杆菌发酵所需的水分；水分过高则会使豆粕中的含氧量降低，抑制枯草芽孢杆菌的生长繁殖。因此，选择0.6 mL/g为枯草芽孢杆菌发酵豆粕的最佳液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F003图3液料比对豆粕酸溶蛋白含量的影响2.1.4发酵时间对豆粕酸溶蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，枯草芽孢杆菌发酵豆粕的酸溶蛋白含量随发酵时间的延长而不断增加，在48 h时达到最大值为12.22%后，随着时间延长而降低，后趋于稳定。因为枯草芽孢杆菌在发酵前期的生长繁殖，产生大量的酸溶蛋白；随着发酵时间的延长，枯草芽孢杆菌进一步将酸溶蛋白分解成更小的肽和氨基酸。因此，响应面试验设计发酵时间中心点选择48 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F004图4发酵时间对豆粕酸溶蛋白含量的影响2.2响应面试验优化发酵条件结果2.2.1响应面优化试验结果（见表2、表3）为进一步确定枯草芽孢杆菌发酵豆粕的最佳工艺条件，在单因素试验结果的基础上，选择接种量、液料比和发酵时间等3个因素，发酵温度为37 ℃，以酸溶蛋白含量为响应值，进行响应面回归分析。根据Box-Behnken对枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕工艺参数设计了17个试验组。使用Design-Expert软件对试验数据进行多元回归拟合，回归方程为：Y=12.78+0.76A-0.26B-0.31C-0.058AB-0.39AC+0.003 875BC-2.28A2-3.32B2-2.92C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.T002表2Box-Behnken设计方案及试验结果编号ABC酸溶蛋白/%1-1017.051 8201-16.746 33-1-106.620 940116.038 1500012.765 66-1106.162 1700012.774 281-108.482 590-116.495 6100-1-17.219 31100012.915 2121107.790 313-10-16.804 9141017.561 11510-18.864 31600012.620 71700012.813 4由表3可知，试验建立的二次回归模型极显著（P0.01），失拟项为P=0.113 00.05，失拟项不显著，表明模型与试验值结果拟合较好。同时回归方程的复相关系数R2=0.998 5，表明99.85%可变动性可以应用该响应面模型解释。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.T003表3回归模型的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型120.04913.34534.270.000 1A4.5914.59183.790.000 1B0.5410.5421.690.002 3C0.7710.7731.000.000 8AB0.01410.010.550.484 2AC0.6010.6024.060.001 7BC6.01×10-516.01×10-52.41×10-30.962 2A221.97121.97879.900.000 1B243.92143.921 759.360.000 1C235.98135.981 441.210.000 1残差0.1770.03失拟项0.1330.043.850.113 0纯误差0.0540.011总和120.2216注：R2=0.998 5。2.2.2各因素交互作用对豆粕酸溶蛋白含量的影响（见图5~图7）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F005图5接种量和时间交互作用对豆粕酸溶蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F006图6液料比和时间交互作用对豆粕酸溶蛋白含量的影响结合表3观察响应曲面和等高线图的形状，分析3个因素对豆粕酸溶蛋白含量的影响。其中，图7中等高线图椭圆的程度显著（P0.05），表明接种量和液料比这两个交叉因素影响显著。由图5~图7可知，响应曲面均为向下开口的凸面，最大值由椭圆轮廓图表面上突出处预测，确定最佳发酵条件为接种量12.24%、时间47.24 h、液料比0.586 mL/g。在此条件下验证得到的酸溶蛋白含量为12.880 5%，与模型预测值12.858 4%较为吻合，表明该模型能够较好地反映枯草芽孢杆菌发酵工艺优化的实际情况。考虑实际生产情况，发酵条件为接种量12%、时间为47 h、液料比0.58 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.F007图7接种量和液料比交互作用对豆粕酸溶蛋白含量的影响2.3最佳工艺条件发酵前后豆粕营养成分测定结果（见表4）由表4可知，发酵后粗蛋白含量增加了8.20%。游离氨基酸和肽含量经过发酵后显著增加（P0.05），棉籽糖和水苏糖发酵后被完全降解，脲酶活性显著降低（P0.05），胰蛋白酶抑制因子含量显著降低至19.86 mg/g（P0.05），大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分别降低了26.68%和44.97%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.015.T004表4发酵前后豆粕中营养物质含量（干物质基础）项目豆粕发酵豆粕粗蛋白/%46.1±0.6449.88±0.23*粗灰分/%6.80±0.297.10±0.17游离氨基酸/(mg/g)41.58±0.1044.64±0.11*肽含量/%2.17±0.176.74±0.09*棉籽糖/(mg/g)12.51±0.23ND*水苏糖/(mg/g)51.00±2.31ND*脲酶/(mg/g)0.26±0.010.07±0.01*胰蛋白酶抑制因子/(mg/g)58.20±1.1219.86±0.66*大豆球蛋白/(mg/g)324.46±0.09237.80±5.71*β-伴大豆球蛋白/(mg/g)669.63±4.62368.52±5.31*注：“*”表示差异显著（P0.05）；ND表示未检出。3讨论豆粕中酸溶蛋白含量是衡量豆粕饲料品质的一项重要指标。经枯草芽孢杆菌发酵后，豆粕的酸溶蛋白含量提高，而酸溶蛋白可提高饲料的消化率。本研究结果显示，影响发酵豆粕中酸溶含量因素由强到弱为：发酵时间接种量液料比。最优工艺参数为发酵温度37 ℃、接种量12%、时间为47 h、液料比0.58 mL/g，与张佳斌等[17]使用枯草芽孢杆菌发酵豆粕条件中液料比1 mL/g相比，本研究得到的工艺液料比较低，节省了原材料，更具有经济价值。与李舒宇等[18]发酵102 h得到酸溶蛋白含量23%的结果相比，本研究的优化工艺发酵时间更短，但得到的酸溶蛋白含量差异不大，表明试验节省了生产加工的时间，提升了工作效率。枯草芽孢杆菌在发酵过程中的生长繁殖能够改善豆粕的营养成分含量和组成[19]。饲料中粗蛋白质含量是衡量饲料价值的常用重要指标之一。枯草芽孢杆菌发酵豆粕可分解各种非蛋白氮转化成具有生物活性的菌体蛋白[20]。本研究发现，最佳发酵工艺发酵的豆粕中粗蛋白含量增加了8.2%，显著高于原料豆粕（46.1%），高于魏曼琳等[14]和李杰等[4]的研究，营养价值更高。研究表明，饲料中氨基酸含量提升有利于育肥猪的生长性能和营养排泄的优化[21]。本试验中肽和氨基酸的含量变化趋势与李莹等[12]研究结果相似，对比10种不同发酵豆粕与未发酵豆粕的营养成分含量，其中游离氨基酸和肽含量均显著提升。本研究枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的游离氨基酸含量达44.64 mg/g，肽含量显著增加了2.1倍。肽具有抗氧化性、改善口感、易吸收的优点[1]，发酵过程中蛋白酶分解大分子蛋白质生成具有生理活性的小分子多肽，更利于动物对蛋白质的吸收利用。此外，豆粕中的抗营养因子含量限制其在饲料中的添加量，然而枯草芽孢杆菌发酵作用对豆粕中的抗营养因子具有分解作用，这为解决豆粕实际应用问题提供了一种方案。棉籽糖和水苏糖属于非还原性低聚糖，动物不能消化吸收，极易造成仔猪腹泻和消化不良[22]。发酵豆粕中的棉籽糖和水苏糖被完全降解，这与菌体分泌对低聚糖具有降解作用的α-半乳糖苷酶息息相关[23]。原料豆粕中的脲酶会降低机体氮的利用，还会引起动物肠道感染[24-25]。本研究中，脲酶活性显著降低，豆粕的饲喂价值和动物利用率有所提高。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白作为豆粕中典型的致敏蛋白，会使动物产生超敏反应，引起腹泻、肠道菌群紊乱等症状[26]。本研究发酵豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分别降低了26.68%和44.97%，与杨慧等[27]研究趋势一致，降低了豆粕致敏的风险，提高了使用安全度。4结论本研究优化了枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕的最佳发酵条件，有利于节省生产能源消耗、控制成本。利用枯草芽孢杆菌对豆粕进行发酵的过程中，影响其酸溶蛋白含量的因素从强到弱排序为：发酵时间接种量液料比。最终获得最佳工艺参数：发酵温度37 ℃、接种量12%，时间47 h，液料比0.58 mL/g。与发酵前相比，最佳工艺发酵豆粕的粗蛋白含量高达49.88%，游离氨基酸和肽含量也显著提升，同时显著降解了致敏蛋白、脲酶和低聚糖等抗营养因子含量，改善了豆粕的营养品质。