构树叶为桑科（Moraceae）构树属（Broussonetia）植物构树的干燥叶，性凉，气微，味淡微涩，具有清热凉血、利湿杀虫的功效[1-2]，收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》。民间常将构树叶用于防治湿疹、皮炎、顽癣等皮肤病[3-4]。构树种植广泛、天然易得，构树叶中富含粗蛋白、粗脂肪、必需氨基酸、多糖等营养成分[5]，已被纳入《饲料原料目录》中，用于替代畜禽饲料中的部分豆粕[6-7]。因此，构树叶作为一种新型、绿色、高效的原料资源，可用于预防、治疗疾病，促进禽畜生长，且不产生药物残留，受到禽畜养殖者、兽药生产企业的广泛关注[8-9]。王文君等[10]研究发现，构树叶中化学成分含量高于其他部位，进一步证明了叶部位应用的优势。王齐[11]通过生物检测技术研究，证明了构树叶总黄酮具有显著的体内-体外疗效。研究表明，构树叶富含黄酮类、酚酸类、木脂素类、糖苷类、萜类和紫罗兰酮类等化合物，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用[12-13]。关于以黄酮类等为主要功效成分在畜禽生产中的研究与应用受到了研究人员的普遍认可[14-15]。不同来源批次间的构树叶质量是评价其饲喂效果的重要前提。目前尚无统一的规范或标准评价构树叶的品质一致性。基于此，本研究以黄酮类、酚酸类为指标成分，建立不同地区来源构树叶的HPLC特征图谱，结合多成分含量测定分析构树叶中黄酮类和酚酸类特征成分。借助聚类分析和主成分分析方法探究不同批次构树叶的异同，为科学、准确地全面评价构树叶的质量以及构树叶的开发应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂绿原酸（批号：2253891，纯度98.9%）、新绿原酸（批号：2204349，纯度97.4%）购自上海安谱有限公司，野黄芩苷（批号：wkq17122012，纯度≥98%）购于四川维克奇生物公司，隐绿原酸（批号：220312，纯度98%）、荭草苷（批号：220314，纯度98%）、牡荆苷（批号：220301，纯度98%）、异牡荆素（批号：220310，纯度98%）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（批号：220418，纯度98%）购自成都植标化纯生物技术有限公司。色谱乙腈购自Fisher公司，水为超纯水。采集构树叶共16批，16批构树叶来源信息见表1。采收的构树叶于通风处阴干。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.T001表116批构树叶来源信息编号采集地点采集日期编号采集地点采集日期S1贵州贞丰县2022.08.31S9河南汝州市2022.09.03S2贵州务川县2022.09.01S10河南确山县2022.09.05S3广西宜州区2022.09.01S11山西临县2022.09.05S4广西合浦县2022.09.02S12山西平顺县2022.08.29S5四川广安区2022.09.03S13河南武陟县2022.08.29S6四川彭州市2022.08.20S14河南兰考县2022.08.17S7河南桐柏县2022.08.25S15河南原阳县2022.08.21S8河南罗山县2022.08.26S16河南中牟县2022.08.231.2仪器与设备Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）、AUW 220D电子分析天平（岛津公司）、KQ-500E超声波清洗仪（昆山市超声仪器公司）。1.3试验方法1.3.1液相色谱条件色谱柱：Thermo Scientific Syncronis C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0~12 min，15%乙腈；12~17 min，15%~23%乙腈；17~24 min，23%乙腈；24~32 min，23%~30%乙腈；32~37 min，30%~45%乙腈；37~41 min，45%~60%乙腈；41~45 min，60%乙腈）；设定波长330 nm；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温35 ℃。1.3.2对照品溶液的配制分别精密称定新绿原酸4.78 mg、绿原酸9.51 mg、荭草苷3.44 mg、异牡荆素4.84 mg、隐绿原酸2.36 mg、牡荆苷1.99 mg加入5.00 mL容量瓶中，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷4.49 mg加入1.00 mL容量瓶中，野黄芩苷4.68 mg加入2.00 mL容量瓶中，用70%乙醇，分别溶解、定容、摇匀。吸取上述各溶液0.50 mL，于同一5.00 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀，得混合对照品溶液。上述各溶液于4 ℃避光保存。1.3.3样品溶液S1的制备取构树叶粉末（过4号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，称重，超声30 min，冷却，用60%乙醇补重，摇匀，经0.45 μm滤膜，取续滤液，供HPLC测定。2结果与分析2.1共有峰的标定色谱条件参考文献[16]至文献[17]中方法并加以改进。取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样测定，对照品溶液和S1样品溶液的色谱图如图1所示。比较色谱峰保留时间与光谱图，确认峰2（6.409 min）、峰4（11.669 min）、峰5（12.774 min）、峰11（25.322 min）、峰13（30.100 min）、峰14（31.298 min）、峰15（32.376 min），峰16（37.144 min）依次为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、荭草苷、牡荆苷、异牡荆素、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，各峰分离度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.F001图1对照品溶液（A，红色）和S1样品溶液（B，黑色）的HPLC色谱图2.28个成分含量测定及方法学考察结果2.2.1线性关系考察精密量取“1.3.2”项下混合对照品溶液，以70%乙醇依次稀释不同浓度（1、2、4、20、40倍），制成各线性溶液，测定并制作标准曲线，得到8个待测成分的线性回归方程，见表2。由表2可知，8个对照品线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.T002表2构树叶中8个成分的线性回归方程成分回归方程线性范围/(mg/L)R2新绿原酸Y=26.74X-0.277 42.39~95.600.994 0绿原酸Y=28.45X+7.651 04.57~182.780.999 1隐绿原酸Y=19.41X-4.599 01.18~47.200.999 7荭草苷Y=23.24X-1.019 01.72~68.991.000 0牡荆苷Y=27.66X+0.684 91.00~39.801.000 0异牡荆素Y=31.92X+2.323 02.42~96.801.000 0野黄芩苷Y=28.95X+5.578 05.85~234.001.000 0芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷Y=19.57X+9.146 011.23~449.000.999 82.2.2精密度试验结果（见表3）取“2.2.1”项下稀释2倍浓度的混合对照品溶液，连续进样6次。由表3可知，8个成分峰面积相对标准偏差（RSD）小于1.5%，仪器精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.T003表3构树叶中8个成分的精密度、稳定性、重复性结果（n=6）项目精密度RSD重复性RSD稳定性RSD新绿原酸1.111.481.25绿原酸0.951.340.98隐绿原酸1.281.401.73荭草苷1.421.631.81牡荆苷1.031.171.39异牡荆素1.471.621.20野黄芩苷1.191.071.12芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷1.140.861.09%2.2.3重复性试验结果（见表3）制备构树叶S1样品溶液6份，进样测定，记录色谱图，应用外标法进行含量计算。由表3可知，8个成分的含量RSD小于1.7%，方法重复性良好。2.2.4稳定性试验结果（见表3）制备构树叶S1样品溶液，于0、2、4、8、12、16、20 h测定，计算各成分峰面积RSD。由表3可知，8个成分峰面积RSD小于1.9%，样品溶液在20 h内稳定。2.2.5构树叶中8个成分加样回收率结果（见表4）取已知含量的构树叶S1样品约0.25 g，精密加入相应含量的各对照品，制备溶液并测定，计算平均回收率。由表4可知，试验所用方法准确度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.T004表4构树叶中8个成分加样回收率结果（n = 6）项目含量/mg加入量/mg测得量/mg平均回收率/%RSD/%新绿原酸0.3000.2960.605103.02.0绿原酸0.6670.6581.32099.22.1隐绿原酸0.2400.2350.47097.92.5荭草苷0.1570.1590.319101.63.5牡荆苷0.1850.1990.38198.72.3异牡荆素0.5000.4830.988100.91.8野黄芩苷1.2481.1692.40799.10.7芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷2.4592.2474.65097.51.32.2.6构树叶中8个成分含量测定结果制备16批样品溶液并测定，外标法计算8个成分的含量，结果见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.T005表5构树叶中8个成分的含量测定结果（n=2）样品新绿原酸绿原酸隐绿原酸荭草苷牡荆苷异牡荆素野黄芩苷芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷总量S13.184.961.530.400.952.844.8412.1230.82S23.265.101.280.360.922.724.7912.2730.70S33.434.171.720.400.812.564.6713.9631.72S43.524.451.440.550.872.624.5213.8431.81S53.003.451.390.470.931.815.5612.0628.67S62.943.611.610.320.901.795.1711.1827.52S73.023.290.960.650.761.765.508.8524.80S83.283.821.070.621.001.515.4310.1226.85S92.522.521.130.430.701.785.069.3023.44S102.942.771.030.390.751.494.5411.0925.00S111.590.960.690.300.271.132.525.2412.69S122.050.760.480.190.210.812.754.6611.91S131.651.231.260.340.401.062.364.2212.52S141.791.050.930.290.321.152.515.0813.12S151.841.641.370.450.291.122.385.2014.30S161.831.381.140.330.230.922.264.0012.08mg/g2.3构树叶特征图谱及相似度评价分别制备16批样品溶液进样测定。得到的色谱图用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）处理。以S1作为参照图谱（R），自动匹配色谱峰，构树叶特征图谱的共有模式见图2。参考文献[18]至文献[19]中的方法，比较各对照品的保留时间和各样品的特征图谱，确定共有峰18个并指认其中的8个，16批构树叶与对照图谱相似度结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.F002图216批构树叶（S1~S16）特征图谱及对照图谱（R）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.T006表6构树叶样品与对照图谱相似度样品相似度样品相似度S10.992S90.921S20.985S100.936S30.987S110.852S40.971S120.814S50.964S130.825S60.954S140.876S70.933S150.848S80.940S160.8352.4主成分分析主成分分析利用降维算法，将复杂多样的数据信息转化为少数几个综合变量的多元统计方法，并体现主要信息，去除数据中相互重叠的信息，目前已被广泛应用于药材、食品等品质评价和指标筛选研究中[20-21]。SPSS软件处理各样品中8个指认峰峰面积，对峰面积进行标准化处理，得到主成分方差贡献率。以方差贡献率为权重，对各批样品进行评价，得分高低与该批样品品质成正比（见图3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.F003图3主成分分析结果由图3可知，2个主成分累积贡献率分别为56.46%和27.22%，合计为83.68%。16批样品分成3类，S1~S6为第一类，S7~S10为第二类，S11~S16为第三类。从主成分分析结果分析，含量综合结果较高的样品，均集中在第一类中；第二类次之，第三类样品指标性成分含量与前两类中样品差异较大。本研究中贵州和广西产地的药材综合评分高于其他产地，这2个产地的药材品质较好。河南产地的药材，第二类中的品质优于第三类，分析第二类产地为河南南部，第三类为河南北部，可能受纬度与环境的影响，河南南部产构树叶药材的品质优于北部产地。2.5聚类分析结果聚类分析是将数据对象进行分组的方法，每个组中的对象密切相关，具有较高相似度，但区别于其他组中的对象，该分析方法广泛应用于医药、食品、饲料等研究中[22-23]。以16批样品的8个指认峰峰面积为基础，运用SPSS软件进行聚类分析，结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.022.F004图4聚类分析结果由图4可知，类间距离为10时，样品可以聚为3类，第一类为S1~S6，第二类为S7~S10，第三类为S11~S16。表明不同批次药材间差异明显，8个成分含量能够最大程度代表不同药材间的差异，该方法可以有效地将构树叶区分开。3讨论本研究对构树叶测定的色谱条件进行了选择，分别考察了不同流动相对色谱图的影响，发现甲醇为有机相，牡荆苷、异牡荆素与野黄芩苷3个峰的分离较差，而选用乙腈时分离结果得到改善；乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相时，各峰分离度满足要求、峰形良好。查看样品的三维光谱图，显示330 nm波长下色谱峰的数量较多，各峰较高，故选择330 nm作为检测波长。王述柏等[24]报道了以乙醇为溶剂，微波辅助提取构树叶总黄酮的提取工艺，并验证了工艺的稳定性和实用性。张兴荣等[25]以响应面法优化构树叶总黄酮的最佳提取工艺，并分析了提取物中黄酮类成分。徐百昌等[26]采用超声波辅助提取杂交构树叶中的多酚，考察了乙醇为溶剂的提取工艺准确可行，并证明构树叶多酚具有良好的抗氧化活性。本研究考察了不同提取溶剂（水、甲醇、乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇）时，超声、加热回流等两种提取方法对指标成分提取的影响，结果显示，以60%乙醇超声30 min提取时效率最高，该提取方法操作简单、便捷。目前，构树叶相关的质量标准尚未统一。丛培臣等[27]对构树叶质量标准的研究中以牡荆苷为指标成分，建立了高效液相色谱含量测定的方法。本研究建立HPLC特征图谱结合多成分含量测定方法，获得18个共有峰。共有峰保留时间稳定，占总峰面积的98%以上，整体相似度范围在0.814~0.992。采用对照品比较的方法[28]，确定8个峰的归属，该8个成分能够体现构树叶整体分类信息，可将这8个成分作为构树叶特征成分。聚类分析与主成分分析结果一致，16批样品聚为3类，且与相似度分析结果相符，说明所建立方法能够有效地分类、识别不同产地构树叶样品，评价其内在质量。从含量测定结果可知，不同批次样品中主要成分有芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷、绿原酸和新绿原酸，样品中各成分含量差异较大，S1~S10是纬度靠南产地的样品，4个成分含量均较高。绿原酸和新绿原酸为酚酸类，酚酸类含量与植物光照时间和强度密切相关，光合作用强，植物叶中的酚酸类含量高[29-30]。芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷为黄酮类，其含量与产地的关系尚无明确结论。本文因采样存在局限性，后期将扩大产地收集范围，增加采集样本量，并进行深入的质量研究。4结论本研究建立了构树叶特征图谱，获得18个共有峰，确定了其中8个峰的归属，将这8个成分作为构树叶特征成分，并用外标法同时测定含量。应用主成分分析及聚类分析对构树叶药材进行质量评价，能够有效分类、识别不同产地的样品，为构树叶质量标准的全面制定和提高提供参考。