引言粪大肠菌群是自然界中分布较为广泛且主要源自动物粪便的肠杆菌科细菌，若水质检测中粪大肠菌群检测结果呈阳性，说明水质已经被大肠菌群污染，大肠菌群的数量越多表明水质污染越严重[1-2]。根据《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法》（HJ 755—2015）规定，粪大肠菌群是在44.5 ℃培养24 h能够发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，是地表水和废水检测中的关键指标之一。目前，关于水质粪大肠菌群的快速检测方法主要有纸片法和酶底物法等。快速纸片法因其操作简单、检测快速等特点，被用于水质粪大肠菌群的快速检测[3-4]。针对地表水和废水中粪大肠菌群的测定，HJ 755—2015虽然规定了清洁水样和污染水样的不同接种水量，但不能有效排除水质样品色度变化对阳性纸片判读的干扰和对检测结果准确性的影响。关于水质样品色度对纸片法测定粪大肠菌群的具体干扰评估鲜少研究。为了深入探究水质样品的色度变化对粪大肠菌群测定的干扰，文中设置7个水质样品色度，采用纸片法对其粪大肠菌群数值进行测定，并利用统计分析法对其干扰进行评估。1实验材料与方法1.1实验菌株实验使用的粪大肠菌群(HJQC-004)购自中国工业微生物菌种保藏中心。1.2实验试剂与仪器实验仪器包括水质粪大肠菌群检验纸片（广东环凯微生物科技有限公司）、恒温培养箱（上海科恒实业发展有限公司）、半自动高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、纯水仪（南京易普易达有限公司）。1.3色度样品原液制备取适当棕褐色液体样品，121 ℃高压蒸汽灭菌处理20 min，得到无菌色度样品原液。1.4实验方法（1）色度梯度样品制备与色度测定。将色度样品原液按照一定比例进行稀释，得到7个色度梯度的色度样品。根据自然倍数稀释法，取静置15 min的澄清样品倒入50 mL具塞比色管至50 mL刻度线，量取25 mL样品并加入25 mL水稀释，混匀备用，按照2倍稀释方法由小到大逐级进行稀释，每稀释1次，按照目视比色方法观察，直至刚好与水无法区别时停止稀释，得到样品的稀释倍数[5]。（2）菌株接种与培养。按照2∶1的比例将菌液与色度样品混匀，每个样品按照3个10倍递减的不同接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，共接种15袋纸片。接种水样被均匀滴加在纸片上，纸片充分浸润、吸收水样，将塑料袋抚平并做好标记，袋口朝上竖直放置，(44.5±0.5) ℃恒温培养24 h[3]。（3）质量控制。每个样品进行3次平行实验，利用无菌水按照1.4.2步骤进行实验室空白质量控制。（4）实验结果判读。阳性结果判读：纸片上出现红斑或红晕且周围变黄；纸片全变黄，无红斑或红晕。阴性结果判读：纸片部分变黄，无红斑或红晕；纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄；纸片无变化。MPN值计算：根据不同接种量的阳性纸片数量，查找相应的MPN值，若样品进行了稀释，需要按照公式换算得到水样中粪大肠菌群数值。数据分析均采用统计分析方法，采用t检验进行组间数据显著性检验[6]。2结果与分析2.1样品色度检测结果实验设置7个色度梯度的样品，按照2倍稀释法计算，色度0样品的色度数值为0倍，色度1样品的色度数值为16倍，色度2样品的色度数值为32倍，色度3样品的色度数值为64倍，色度4样品的色度数值为128倍，色度5样品的色度数值为256倍，色度6样品的色度数值为512倍。2.2质量控制结果将无菌水按照1.4.2步骤进行接种培养，接种无菌水的纸片均呈阴性，表明本实验的实验室质量控制结果合格，本实验的检测结果有效，符合质控要求。2.3样品色度对粪大肠菌群测定的影响为了初步评估样品色度对粪大肠菌群的判读影响，采用《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法》（HJ 755—2015）要求对7个色度样品进行检测分析，色度检测的颜色变化结果如图1和图2所示。10.3969/j.issn.1004-7948.2023.09.019.F001图15个色度样品的粪大肠菌群检测结果10.3969/j.issn.1004-7948.2023.09.019.F002图23个色度样品的粪大肠菌群检测结果虚线方框表示可判读阳性纸片，每个稀释度若无阳性纸片则记为不可判读。由于菌液浓度与纸片阳性反应存在一定的联系，接种稀释菌液的阳性纸片数不能真实展示样品色度对其阳性反应结果判读的影响，因此以100（无稀释）评估色度变化对其阳性反应结果判读的影响更为准确。由图1和图2可知，在接种粪大肠菌群数一致且菌液无稀释的情况下，随着样品色度的增加，可判读的阳性反应纸片数逐渐减少，当样品色度增加到32倍、64倍、128倍、256倍和512倍时其纸片的阳性反应均显示不可判读。为了进一步测试色度对粪大肠菌群检测值的影响，分别统计分析7个色度样品的粪大肠菌群的MPN值，不同色度样品的菌群检测结果如图3所示。**表示两端色度样品的粪大肠菌群存在极显著差异。图3不同色度样品的菌群检测结果10.3969/j.issn.1004-7948.2023.09.019.F3a1（a）实验一10.3969/j.issn.1004-7948.2023.09.019.F3a2（b）实验二由图3可知，实验一中，色度0样品的粪大肠菌群MPN值为423.3±90.7，色度1样品的粪大肠菌群MPN值为420.0±96.4，色度2样品的粪大肠菌群MPN值为93.3±15.2，色度3样品的粪大肠菌群MPN值为53.3±15.2，色度4样品的粪大肠菌群MPN值为36.6±15.2。实验二中，色度0样品的粪大肠菌群MPN值大于24 000，色度5样品的粪大肠菌群MPN值为130.0±20.0，色度6样品的粪大肠菌群MPN值为90.0±20.0。随着样品色度的增加，样品的粪大肠菌群检测值逐渐变小。经统计分析结果显示，色度1样品的粪大肠菌群与色度0样品的粪大肠菌群无显著差异，其余5个色度（色度2、色度3、色度4、色度5和色度6）样品的粪大肠菌群与色度0样品存在极显著差异。2.4进一步评估样品色度对粪大肠菌群测定的影响为了进一步验证提高菌液浓度是否会减轻样品色度对其阳性反应纸片数判读的干扰，选择在色度5和色度6样品的基础上增加菌液浓度继续实验，结果如图4所示。10.3969/j.issn.1004-7948.2023.09.019.F004图4菌液浓度继续实验结果色度0样品的粪大肠菌群MPN值大于24 000，色度5样品的粪大肠菌群MPN值为170.0±20.0，色度6样品的粪大肠菌群MPN值为163.3±30.0。与色度0样品相比，色度5和色度6样品的粪大肠菌群呈极显著差异。增加菌液浓度后的两个色度样品的粪大肠菌群检测结果如图5所示。虚线方框表示可判读阳性纸片，每个稀释度若无阳性纸片则记为不可判读。随着菌液浓度的增加，可判读的阳性纸片数多于菌液浓度较低（见图2）时的纸片数，表明提高菌液浓度可以适当减轻样品色度对其阳性反应纸片数判读的干扰。10.3969/j.issn.1004-7948.2023.09.019.F005图5增加菌液浓度后的两个色度样品的粪大肠菌群检测结果3结语水质样品色度变化对纸片法测定粪大肠菌群存在一定的影响，发现在接种粪大肠菌群数一致且菌液无稀释的情况下，随着水质样品色度的增加，可判读的阳性纸片数会逐渐减少，当样品色度增加到32倍、64倍、128倍、256倍和512倍时其纸片的阳性反应均显示不可判读，同时其粪大肠菌群的MPN检测值也随着样品色度的增加而逐渐变小。此外，提高水质样品中的粪大肠菌群浓度，能够在一定限度上减缓水质样品色度变化对纸片法测定结果的干扰，有利于阳性纸片的判读。水质样品色度变化会干扰纸片法的阳性纸片判读，从而在一定程度上降低其测定有色水质样品中粪大肠菌群结果的准确性和可靠性。当水质样品中粪大肠菌群数含量不高且颜色较深的情况下，不宜采用纸片法测定其菌群数。