乳脂肪是决定牛奶营养品质的主要参考指标，乳脂肪在牛乳中的含量为3.0%~5.0%[1]。TG是乳脂的重要组成部分，主要由从头合成的短链脂肪酸（C4-C14）和来自循环血液中吸收的长链脂肪酸（C16-C20）共同构成[2]。反刍动物在泌乳高峰期间需要大量的能量来源，因此，需要用高精料满足泌乳动物对高能量的需要。但长期饲喂高精料容易引发亚急性瘤胃酸中毒，瘤胃pH值下降会使瘤胃生物菌群的结构遭到破坏，导致产生大量的革兰氏阴性菌脂多糖（LPS），并且LPS可通过血液循环进入乳腺造成氧化损伤，最终导致乳脂率和乳品质下降[3-4]。目前，乙酸钠作为饲料添加剂的应用研究主要集中于改善动物胃肠道微生物组成、炎症反应和生长性能等方面[5-6]，在乳腺泌乳性能及乳腺炎的防治方面研究较少。因此，本试验向LPS诱导的牛乳腺上皮细胞系（MAC-T）细胞脂肪变性模型中添加不同浓度的乙酸钠，分析其对MAC-T细胞脂肪变性的改善作用，以期为乙酸钠改善泌乳期奶牛乳品质及促进乳业健康发展提供参考。1材料与方法1.1细胞来源MAC-T购自青旗（上海）生物技术发展有限公司。1.2MAC-T细胞脂肪变性模型建立根据本实验室前期试验结果可知，1 000 μg/L LPS刺激细胞9 h后，MAC-T活力极显著下降[7]。因此，本研究选择LPS刺激浓度为1 000 μg/L，时间为9 h。MAC-T细胞在含有10%的胎牛血清（1%100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素）的DMEM培养基中培养。当细胞达到80%~90%的融合度时，将MAC-T细胞接种于6孔板中，采用1 000 μg/L LPS刺激细胞9 h，收集上清和细胞在冰上超声破碎，4 °C、2 500×g离心10 min，提取上清。将收集的细胞上清进行TG含量检测，每个处理设3个平行孔。将MAC-T细胞接种于含有细胞爬片的6孔板（1×106个细胞/孔）中进行培养，加入1 000 μg/L LPS的不完全培养液，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养9 h。取出细胞爬片，PBS冲洗3遍，10%福尔马林静置固定30 min，油红O染液染色处理，再次用PBS缓冲液冲洗3次将染液冲洗干净，将细胞爬片置于显微镜下观察细胞脂肪变性情况[7]。1.3乙酸钠对MAC-T细胞脂肪变性模型的影响将细胞分为5组：对照组、LPS处理组、2 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组。各乙酸钠处理组MAC-T细胞先加入不同浓度的乙酸钠，2 h后加入LPS，培养箱中培养10 h后，收集各孔细胞，冷冻保存，每组处理设置3个平行孔。相关炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）及甘油三酯（TG）含量测定严格按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书操作。1.4乙酸钠对MAC-T细胞脂代谢相关关键酶的影响采用Trizol试剂直接提取MAC-T细胞总RNA。利用ND-1000微量紫外可见分光光度计检测总RNA的纯度（OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0范围）和浓度。取1 μg总RNA进行反转录得到cDNA。相关引物设计交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.T001表1目的基因及β-Actin引物序列基因基因检索号引物序列（5'→3'）引物长度/bpβ-ActinNM_001034034GCTAACAGTCCGCCTAGAA180GCAGTCATCACCATCGGCAATGAGACCXM_005219975.4GAGGGTTCAGTTCCAGAAAGTA179CCGCCCTGAAATGAGAGATGFASNM_001285629.1GCACTACCACAACCCAAACCC161CGTTGGAGCCACCGAAGCSCD-1NM_173959.4CCGCCCTGAAATGAGAGATG154AGGGCTCCCAAGTGTAACAGACCPT-1XM_018043311.1CCCATGTCCTTGTAATGAGCCAG254AGACTTCGCTGAGCAGTGCCACPT-2NM_001045889.1ACGCCGTGAAGTATAACCCT119CCAAAAATCGCTTGTCCCTTACOXM_024980020.1TAAGCCTTTGCCAGGTATT189ATGGTCCCGTAGGTCAG1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，独立样本t检验或单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1LPS处理对MAC-T细胞总脂滴面积、TG含量的影响（见图1、图2）由图1可知，对照组MAC-T细胞中脂滴含量丰富，油红染色现象明显，而LPS处理组中脂滴含量明显减少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.F001图1MAC-T细胞脂肪变性情况由图2可知，与对照组相比，LPS处理组MAC-T细胞总脂滴面积、TG含量显著下降（P0.05）。图2LPS处理对MAC-T细胞总脂滴面积及TG含量的影响注：“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.F2a1（a）LPS处理对MAC-T细胞总脂滴面积的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.F2a2（b）LPS处理对MAC-T细胞TGHL的影响2.2乙酸钠对MAC-T细胞TG含量的影响（见图3）由图3可知，与对照组相比，LPS处理组细胞TG含量极显著下降（P0.01）；与LPS处理组相比，4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞TG含量均显著上调（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.F003图3乙酸钠对MAC-T细胞TG含量的影响2.3乙酸钠对MAC-T细胞脂合成代谢相关基因表达的影响（见图4）由图4（a）可知，与对照组相比，LPS处理组细胞ACC mRNA表达极显著下降（P0.01）；与LPS处理组相比，4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞ACC mRNA表达显著上升（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.F004图4乙酸钠对MAC-T细胞脂合成代谢相关基因表达的影响由图4（b）可知，与对照组相比，LPS处理组细胞FAS mRNA表达极显著下降（P0.01）；与LPS处理组相比，4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞FAS mRNA表达显著上升（P0.05）。由图4（c）可知，与对照组相比，LPS处理组细胞SCD-1 mRNA表达极显著下降（P0.01）；与LPS处理组相比，4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞SCD-1 mRNA表达显著上升（P0.05）。2.4乙酸钠对MAC-T细胞脂分解代谢相关基因表达的影响（见图5）由图5（a）可知，与对照组相比，LPS处理组CPT-1 mRNA表达显著上升（P0.05）；与LPS处理组相比，4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞CPT-1 mRNA表达显著下降（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.F005图5乙酸钠对MAC-T细胞脂分解代谢相关基因表达的影响由图5（b）可知，与对照组相比，LPS处理组细胞CPT-2 mRNA表达显著上升（P0.05）；与LPS处理组相比，8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞CPT-2 mRNA表达显著下降（P0.05）。由图5（c）可知，与对照组相比，LPS处理组细胞ACO mRNA表达显著上升（P0.05）；与LPS处理组相比，各乙酸钠+LPS处理组细胞ACO mRNA表达均无明显变化。2.5乙酸钠对MAC-T细胞炎症因子含量的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，LPS处理组细胞TNF-α、IL-6和IL-8含量显著上升（P0.05）。与LPS处理组相比，4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞TNF-α、IL-6含量显著下降（P0.05），8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组细胞IL-8含量显著下降（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.016.T002表2乙酸钠对MAC-T细胞炎症因子含量的影响组别TNF-αIL-6IL-8对照组345.20±31.35a168.10±17.35a425.10±42.24aLPS处理组413.50±45.15b223.10±31.12b478.10±23.53b2 mmol/L乙酸钠+LPS处理组394.20±48.63b212.10±12.58b464.10±25.63b4 mmol/L乙酸钠+LPS处理组350.20±48.24a190.10±16.02a456.30±47.21b8 mmol/L乙酸钠+LPS处理组347.30±35.13a191.20±11.24a435.10±52.79a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。μg/L3讨论牛奶中的脂肪含量是衡量牛奶品质的主要指标之一，乙酸是奶牛从头合成脂肪酸的主要底物，乙酸在乳腺当中经过加工可以合成乳中的短链脂肪酸、C4-C14中链脂肪酸和部分长链脂肪酸[8-9]。此外，乙酸可以作为2碳供体通过异柠檬酸途径合成丙二酰辅酶A和NADPH[10]。乙酸是营养良好的奶牛瘤胃中产生的主要挥发性脂肪酸，提供了挥发性脂肪酸代谢产生的45%的能量[11]。因此，乙酸是满足奶牛能量需求和乳脂肪合成的重要基础。一般情况下为弥补高泌乳期奶牛能量不足，需要向饲料中添加高精料。但饲喂大量的高精料日粮会使瘤胃快速发酵，短时间内生成大量的挥发性脂肪酸，加之高精料饲喂会减少唾液分泌量，无法及时去稀释瘤胃液，最终导致pH值降低。pH值降低会导致革兰氏阴性菌大量死亡，释放高浓度的LPS[12]。LPS可通过损伤瘤胃屏障功能，穿过瘤胃壁释放到血液中，随着血液通过乳动脉进入到乳腺引发乳腺炎，进而降低乳品质[13]。3.1乙酸钠对MAC-T细胞脂肪变性的影响王亚玲等[14]研究发现，饲料中添加乙酸钠不仅可改善瘤胃微生物组成和结构，也可显著提高奶山羊日奶产量和乳脂率。秦昆鹏等[15]发现，在白羽肉鸡饲粮中添加乙酸钠，可以改善肉品质，增加血液中低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的含量，但过量添加会导致血脂上升。此外，向泌乳奶牛饲粮干物质中添加2.9%的乙酸钠可提高乳脂产量和浓度[10]。本研究发现，使用1 000 μg/L LPS刺激MAC-T细胞9 h后，会显著下调细胞总脂滴面积和细胞内TG含量，表明LPS可引发MAC-T细胞的脂肪变性。进一步通过不同浓度的乙酸钠和LPS共同孵育MAC-T细胞，发现与LPS处理组相比，4、8 mmol/L乙酸钠+LPS处理细胞的TG含量均显著上调。本试验结果表明，使用不同浓度乙酸钠孵育细胞后会改善LPS造成脂代谢紊乱状态，提高细胞内TG含量，其中4、8mmol/L乙酸钠处理细胞效果最为显著。3.2乙酸钠对MAC-T细胞脂代谢关键酶的影响乳脂肪的从头合成需要多种酶的调控，其中ACC是脂肪酸从头合成中的限速酶，催化ATP依赖性乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A[16]。FAS是脂肪酸从头合成的关键蛋白，在牛奶脂肪生成和分泌中起到重要作用，其主要产物是脂肪酸延伸和TG合成的重要底物[17]；而SCD-1负责脂肪酸去饱和[18]。本研究结果显示，与对照组相比，LPS处理组中脂肪酸合成代谢的相关酶ACC、FAS和SCD-1 mRNA表达水平均受到抑制；而与LPS处理组相比，4、8 mmol/L乙酸钠与LPS共同孵育会使ACC、FAS的mRNA表达水平上调，表明乙酸钠可激活MAC-T细胞中脂合成代谢相关酶的活性。4 mmol/L乙酸钠与LPS共同孵育也会使SCD-1 mRNA表达水平显著上升。肉毒碱棕榈酰基转移酶催化长链和中链脂肪酸从细胞质转移到线粒体，在线粒体中脂肪酸发生氧化。CPT-1、CPT-2是长链脂肪酸氧化速率的控制酶，脂肪酸β-氧化过程受CPT-1、CPT-2调控[19]。本研究中，与对照组相比，在LPS处理下，脂肪酸分解代谢的相关酶表达水平均显著上升；与LPS处理组相比，4、8 mmol/L乙酸钠与LPS共同孵育的情况下，CPT-1的mRNA表达水平显著下降；8 mmol/L乙酸钠与LPS共同孵育的情况下，CPT-2 mRNA表达水平显著下降。上述试验结果提示，乙酸钠可通过调控脂代谢关键酶的活性，使MAC-T细胞激活脂肪酸的从头合成途径，抑制脂肪分解代谢。3.3乙酸钠对MAC-T细胞相关炎症因子的影响TNF-α常与IL-1β、IL-6和IL-8等一同参与炎症反应。IL-6是一种分泌蛋白，可刺激B细胞产生抗体，在健康和疾病中的作用受到了很多关注。IL-8是一种由白细胞、内皮细胞和上皮细胞等多种细胞释放的趋化细胞因子，在炎症、肿瘤侵袭或血管中具有多种功能。这些炎症因子通常是导致组织代谢紊乱和功能障碍的关键因素[20-21]。研究发现，在油酸诱导的BRL-3A细胞脂肪变性模型中，乙酸钠对其损伤及脂肪变性等均具有一定缓解作用[22]。本试验发现，LPS会造成MAC-T细胞内相关炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8显著升高，引发细胞炎症反应；其中4、8 mmol/L乙酸钠可减少TNF-α和IL-6炎症因子的分泌，8 mmol/L乙酸钠也可减少IL-8的分泌水平。结果表明，乙酸钠对LPS造成的细胞炎症损伤具有保护作用。4结论本研究结果表明，LPS会造成MAC-T细胞脂肪变性；而4、8 mmol/L乙酸钠会激活脂合成代谢相关酶的活性，抑制脂分解代谢相关酶的活性，进而增加细胞TG的合成，对LPS造成的细胞炎症损伤具有一定的缓解作用。