瘦素是一种主要由脂肪细胞分泌的多肽类激素，主要功能是参与细胞的成熟与生长，可对体内能量代谢、繁殖、免疫功能进行调节[1]。在动物生产中可通过提高家畜的瘦肉率，调节动物机的膘情、体重和生殖活动等[2]。瘦素受体（OB-R）是一种功能性蛋白，可以特异性结合瘦素形成复合体，在介导细胞内信号转导调控胚胎发育、细胞分化及生长等过程中具有重要作用[3-5]。瘦素主要通过与其受体结合，在不同的组织细胞中脂肪贮存发挥功能。研究发现，在卵母细胞成熟的过程中，细胞内脂质含量随发育进程推进逐步降低[6]，而利用小分子抑制剂抑制脂肪酸的β氧化将会导致卵母细胞的减数分裂受阻[7]，表明早期胚胎发育过程中脂肪酸必不可少。李雪华等[8]发现，提高大鼠血清瘦素水平可促进下丘脑OB-R基因表达，抑制下丘脑及血清神经肽Ｙ合成和分泌，进而调控采食。瘦素通过自分泌或旁分泌到达相应靶点，与OR-R结合后，通过脂代谢正向调控早期胚胎发育进程[9-10]。新疆是绵羊养殖大区，存栏量常年位居全国前列，而品种繁殖效率低是制约肉羊养殖发展的瓶颈问题，因此需要开展系统性研究提升本地区绵羊繁殖效率。本研究先确认瘦素及其受体在子宫内膜组织中的表达特征，并以绵羊子宫内膜上皮细胞为体外模型，通过外源添加瘦素明确其对细胞增殖凋亡及胚胎附植关键基因的影响，初步确认瘦素对绵羊子宫内上皮细胞功能的调控作用，以期为深入研究瘦素介导的绵羊胚胎附植调控机制提供参考。1材料与方法1.1试验材料绵羊子宫组织采自新疆石河子市牛羊定点屠宰场，分别采集妊娠45 d和非妊娠绵羊子宫阜内膜组织。绵羊子宫内膜上皮细胞由本实验保存，其分离培养及鉴定方法参考文献[11]。1.2主要试剂瘦素、OB-RB抗体、胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶，均购自美国Glpbio公司，青-链霉素购自HyClone公司，反转录试剂盒购自Takara公司，鼠抗角蛋白18（CK18）单克隆抗体购自Abcam公司，β-actin、BAX、Bcl-2均购自碧云天生物技术公司，Casepase9抗体购自proteintech公司（稀释比1∶1 000），DAPI购自碧云天生物技术公司，山羊抗鼠绿色荧光二抗购自赛默飞。引物均由上海生物工程有限公司合成。1.3试验方法1.3.1子宫内膜组织的免疫组化分析多聚甲醛固定新鲜绵羊子宫内膜组织，采用石蜡包埋在自动切片机包埋成5 μmol/L左右的切片并固定于载玻片上。切片用二甲苯脱蜡，3% H2O2浸泡，使用柠檬酸钠缓冲液煮沸。5%血清封闭后瘦素及其受体一抗孵育4 ℃过夜，二抗室温孵育用DAB试剂显色。显微镜下观察并拍照。1.3.2子宫内膜上皮细胞鉴定子宫阜剪碎接种于6孔板中，加入完全培养基（DMEM/DF12、10%FBS、1%双抗）置于37 ℃、5% CO2中培养箱中培养。原代细胞生长汇合达80%~90%时，加入0.25%胰蛋白酶溶液，消化90 s加入完全培养基终止消化，可得到较纯的子宫内膜上皮细胞。将培养成单层的细胞胰酶消化、传代，参考文献[11]。原代子宫内膜细胞通过光学显微镜和电镜观察法进行形态学鉴定，免疫荧光法鉴定上皮细胞标记蛋白为角蛋白的定位情况。1.3.3筛选药物最佳浓度使用CCK8试剂盒，按照说明书的操作步骤检测细胞毒性。将细胞传代到96孔培养板内，12 h后加入0、50、100、250、500 mg/L瘦素，去除上清液，每孔加含10% CCK8的DF12培养液，培养箱孵育2.5 h，采用酶标仪在450 nm处测定吸光度值，确定瘦素最适浓度。1.3.4细胞迁移能力检测绵羊子宫内膜上皮细胞种于放入插销的12孔板中，于37 ℃、5% CO2培养过夜。细胞密度超过90%，拔掉插销。按0、6、12、24 h取样，拍照，使用ImageJ软件进行图像分析，计算细胞划痕面积。1.3.5基因表达检测采用RT-qPCR的方法对250 mg/L的瘦素处理后的子宫内膜上皮细胞Trizol法提取总RNA，反转录试剂盒提cDNA，进行RT-PCR检测。根据NCBI对目的基因的CDS区设计引物测定Bcl-2相关X蛋白（BAX）、B细胞白血病-2（Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Casepase-3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Casepas-9）、骨桥蛋白（OPN）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮生长因子（VEGF）、子宫内膜附植位点黏蛋白（Muc1）、泛素样修饰因子（ISG15）、白细胞介素-6（IL-6）、基质金属蛋白9（MMP9）、白细胞介素-1β（IL-1β）的表达水平。引物信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.T001表1引物信息基因名称基因序号引物序列（5'→3'）长度/bpBAXNC_056067.1F：GGCAGACGCTGAAGCAGAACAR：CAGACACTCGCTCAGCTTCTTG116Bcl-2NC_056076.1F：TTGAGTTCGGAGGGGTCATR：AGCCAGGAGAAATCAAACAGG114Casepase-3NC_037354.1F：GGTTCATCCAGGCTCTTTGTR：TATTCTGTCGCTACCTTTCG100OPNNC_056059.1F：AGACTGTGGCTGTGCTCAAGR：GCGGGTGCTCATCATCCAT181LIFNM_173931.1F：GTGAGCCATGTGGATGTGACR：CGGCAATGACCTGCTTGTAC248VEGFNC_056073.1F：CCTTGCTGCTCTACCTCR：CCAGACCTTCGTCGTT237MUC1NC_056054.1F：GGGCTTCTGGGACTCTTTR：AGGTTATAGGTGCCTGCTT143ISG15NC_056065.1F：AGACTGTGGCTGTGCTCAAGR：GCGGGTGCTCATCATCCAT264IL-6NC_056057.1F：TGCTGGTCTTCTGGAGTATCAR：ATTCTCAAGGCTTCTCAGGATG197MMP9NC_056066.1F：GGGTAAGGTGCTGCTGTTCAR：GATGTCGTGCGTGCTAATGG130IL-1βNC_056056.1F：CATAACAATCTTGGGAGGACR：AAAGGTAAGCAGGTGGAA165β-actinNM_001206359.1F：ATCGGCAATGAGCGGTTCCR：：CGTGTTGGCGTAGAGGTCTT1451.3.6蛋白免疫印迹采用液氮研磨组织块，组织裂解液冰上裂解离心30 min，取上清为总蛋白。取部分样品用BCA蛋白含量测定试剂盒测定蛋白浓度。将样品稀释至合适浓度进行SDS-PAGE电泳，半干转法转至PVDF膜上，封闭1 h一抗4 ℃过夜孵育，加入标记二抗室温孵育，将膜进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统（ImageJ）分析条带净光密度值，拍照，保存。1.4数据统计与分析采用Excel 2010软件对细胞中的目的及内参基因mRNA表达量进行处理，2-△△Ct法计算基因mRNA的相对表达量，Origin 2022软件进行统计分析。使用Image J software分析Western blotting蛋白条带的灰度值和细胞划痕面积，计算相对蛋白表达量。结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1瘦素在胚胎附植期的定位结果（见图1）由图1可知，通过比较妊娠和未妊娠切片的免疫组化结果发现，瘦素蛋白的免疫着色的程度和着色的位点存在差异。在未妊娠的子宫内膜的基质和上皮中存在较强的瘦素免疫信号，而在妊娠的子宫内膜组织中主要分布在腔上皮。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F001图1绵羊子宫内膜组织切片（50×）注：箭头所指为腔上皮。2.2子宫内膜上皮细胞的迁出纯化和免疫荧光鉴定（见图2）由图2可知，显微镜下观察发现，组织块在3 d部分细胞爬出，5~6 d时呈梭形（基质细胞）和铺路石状（上皮细胞）单层细胞的形式爬行。胰酶差时消化法获得子宫内膜上皮细胞的纯化。免疫荧光结果显示，绵羊子宫内膜上皮细胞角蛋白染色阳性。结果表明，本试验成功分离培养出绵羊子宫内膜上皮细胞。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F002图2子宫内膜上皮细胞的迁出纯化和免疫荧光鉴定2.3瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞增殖的影响（见图3）加入50、100、250、500 mg/L的瘦素处理绵羊子宫内膜已传代三次的上皮细胞，空白对照组为不添加蛋白的完全培养基，以筛选瘦素最佳质量浓度。由图3可知，与对照组相比，250 mg/L瘦素对子宫内膜上皮细胞增殖极显著升高（P0.01）。因此，选择250 mg/L的瘦素处理子宫内膜上皮细胞，作为后续的试验组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F003图3瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞増殖的影响注：“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）；下图同。2.4瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞迁移的影响（见图4）由图4可知，瘦素处理后的第24 h细胞的迁移能力极显著高于对照组（P0.01），表示瘦素在绵羊子宫内膜上皮细胞迁移过程中发挥重要作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F004图4瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响2.5瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞凋亡关键基因mRNA表达的影响（见图5~图6）由图5可知，与对照组相比，试验组Bax、Casepase-3蛋白表达显著减少（P0.05），Bcl-2蛋白表达增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F005图5各组绵羊子宫内膜上皮细胞相关细胞凋亡因子定量结果由图6可知，与对照组相比，添加250 mg/L瘦素细胞Bcl-2表达显著增加（P0.05），BAX、Casepase-3表达显著下调（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F006图6各组绵羊子宫内膜凋亡促进蛋白BAX、Casepase-3、Bcl-2的表达情况2.6瘦素对胚胎附植关键基因mRNA相对表达量的影响（见图7）由图7可知，与对照组相比，试验组细胞Muc1、VEGF、LIF、MMP9、ISG15、OPN mRNA相对表达量显著升高（P0.05），IL-6 mRNA相对表达量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.19.012.F007图7瘦素对胚胎附植关键基因mRNA相对表达量的影响3讨论3.1瘦素在胚胎附植期绵羊子宫内膜组织的定位分析在哺乳动物中，胚胎附植的成败取决于发育良好的囊胚和处于容受态的子宫内膜状态精确同步[12]。深入了解瘦素及其受体的表达特性，是探索瘦素及其受体在动物内作用机制的前提条件。有研究显示，瘦素及其受体在猪非妊娠子宫内膜组织和妊娠的子宫内膜组织中表达存在差异，且妊娠子宫内膜组织显著高于非妊娠子宫内膜组织[8]。本试验发现，瘦素蛋白主要表达在未妊娠绵羊子宫内膜的基质和上皮和妊娠绵羊子宫内膜的腔上皮，表明瘦素在妊娠和未妊娠成年健康绵羊的子宫内膜上皮组织的表达量及定位不同，绵羊子宫内膜可以是瘦素作用的靶组织，瘦素可能在妊娠绵羊胚胎附植的选择定位中发挥了特异性作用。3.2瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞增殖迁移、凋亡的影响胚胎附植的过程本质上是胚胎滋养细胞通过发生增殖、迁移和侵袭，最终介导胚胎在子宫内膜上皮与母体发生紧密联系的过程[13]。胚胎附植过程中子宫内膜上皮细胞的适时增殖和凋亡与胚胎植入密切相关[14]。为系统研究胚胎附植相关机制，需要稳定的体外细胞模型，本研究使用了通过组织块+胰酶差时消化法成功获得的绵羊子宫内膜上皮细胞[11]，利用经免疫荧光鉴定角蛋白CK18确认了该细胞具有上皮样特征，为进一步研究瘦素的相关作用提供了基础。脂代谢调控在早期胚胎发育过程中承担重要角色，磷脂类作为细胞膜的组成成分，当其合成途径受阻时会导致胚胎死亡[15]。有研究表明，外源添加瘦素可通过神经系统调控脂代谢进程，进而提升绵羊的生长速度[16]。本研究使用不同浓度瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞进行处理，结果显示，250 mg/L瘦素可显著增强绵羊子宫内膜上皮细胞增殖活性，而其他浓度对细胞无毒性作用，故选择250 mg/L作为后续试验的添加浓度。结果发现，绵羊子宫内膜上皮细胞迁移能力显著提高，凋亡抑制蛋白Bcl-2的转录和蛋白水平表达均显著增加，而凋亡促进Bax、Casepase-9的蛋白表达显著下调。其中Bax、Bcl-2蛋白表达与定量结果一致，因为同时检测到凋亡促进蛋白Casepase-3基因的转录下调，及其下游关键表达分子Caspase-9的表达，因而初步推测瘦素促进绵羊子宫内膜上皮细胞增殖、迁移，抑制绵羊子宫内膜上皮细胞凋亡。研究表明，维持瘦素水平对保障妊娠顺利进行具有重要意义。3.3瘦素对胚胎附植关键基因mRNA表达的影响在体内正常生理条件下，多种因素参与了子宫内膜细胞的调节[15]。在众多的胚胎附植相关调控因子中，VEGF是一种在胚胎附植血管生成过程中发挥重要作用的因子[16]。本研究发现，在250 mg/L瘦素能够增强细胞中VEGF的表达。LIF可促进胚胎发育，提高胚胎质量及存活力，提高胚胎植入率[17]。本研究结果显示，瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞中的LIF表达也起到了明显的促进作用。本试验发现，添加外源瘦素可抑制IL-6基因的表达，提示了瘦素可能通过调控绵羊子宫内膜上皮细胞的免疫功能参与胚胎附植[18]。子宫内膜附植位点Muc1表达下调是子宫进入容受状态和成功附植的先决条件[19]，OPN也被认定为是一种胚胎附植期子宫进入容受状态的标记分子[20]。本研究结果显示，瘦素对Muc1、OPN具有明显的调节作用，利于绵羊子宫容受性的建立。ISG15是一种在机体天然免疫应答中起重要作用的蛋白，对胚胎的附植具有显著的调控效果[21]。有研究发现，不同剂量的瘦素对ISG15的表达起到了双向作用[22]。本研究显示，250 mg/L瘦素促进了ISG15表达。同样，受到瘦素调节的MMPs家族对胚胎附植也具有重要的作用，主要是通过降解和重塑胚胎附植期子宫内膜组织胞外基质，进而调节蜕膜化和胚胎入侵过程[23-24]。本研究结果显示，瘦素能够促进绵羊子宫内膜上皮细胞中MMP9表达，推测瘦素可能通过调控MMP9的表达调节子宫内膜胞外基质的降解，从而在绵羊的胚胎附植发挥调控作用。子宫内膜相关基因表达也佐证维持瘦素水平对子宫内膜形态和结构具有调控效果。4结论本试验研究表明，瘦素在非妊娠绵羊子宫内膜上皮和基质组织中广泛表达，在妊娠绵羊子宫内膜上皮组织中特异性表达，提示其在胚胎附植过程中具有重要调控作用。利用250 mg/L浓度瘦素处理绵羊子宫内膜上皮细胞可显著促进细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡，并影响胚胎关键基因的表达，从而调节子宫内膜上皮细胞的基本功能，对绵羊胚胎附植进程具有促进作用。