腹泻对犊牛影响较大的疾病之一[1]。犊牛可能出现脱水、食欲下降和站立困难，严重可能会出现共济失调、酸血症、菌血症、心律失常、低血容量，甚至死亡[2]；而存活下来的腹泻犊牛也因体重下降、营养不良等造成经济损失。临床中腹泻通常采用抗生素治疗，但使用抗生素会显著影响胃肠道菌群多样性，进而影响消化吸收及生长发育，容易产生耐药性和药物残留等问题[3]。随着人们对食品安全关注度日益增高以及禁抗令[4]的颁布，寻找抗生素替代品尤为重要。蒙兽药巴特尔-7复方具有抗菌、抗病毒、镇痛、治疗腹泻和感冒头痛及增强免疫等作用[5]。前期在治疗小鼠、犊牛腹泻的试验中发现，蒙兽药巴特尔-7可以起到抑菌、抗炎的作用，能够提高免疫功能，强化肠黏膜屏障，且无毒副作用和耐药性[6]。为了解蒙兽药巴特尔-7治疗犊牛腹泻机制，本试验以E. coli O1致腹泻犊牛模型探索蒙兽药巴特尔-7有效成分复方对腹泻犊牛的影响，为寻找可替代抗生素的天然抑菌剂以及蒙兽药巴特尔-7有效成分复方在治疗犊牛腹泻方面的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验药物乌苏酸（货号：T5536）、蒙花苷（货号：T5535）均购自陕西菲斯特生物科技有限公司；高乌甲素（批号：HR20612W2）购自宝鸡辰光生物科技有限公司。将乌苏酸、高乌甲素、蒙花苷等按比例制成蒙兽药巴特尔-7有效成分复方。兽用环丙沙星（批号：20180316）购自成都新亨药业有限公司。1.1.2试验动物试验选择来自内蒙古鄂尔多斯某牧场的健康荷斯坦犊牛18头，体重（40±2）kg，随机分为6组，每组3头。试验均参考犊牛饲养管理办法实施[7]。1.1.3试剂、菌株及仪器琼脂培养基、肉汤培养基、伊红美兰培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司，ELISA试剂盒购自厦门仑昌硕生物科技有限公司。试验菌株由课题组前期从内蒙古某地区奶牛粪便中分离纯化的致病性大肠杆菌O1（E. coli O1）菌株[8]。LDZM-40KCS型压力蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂，BioTek ELx800型酶标仪购自Biotek美国。1.2试验方法1.2.1致病性E. coli O1的制备制作营养琼脂培养基，将致病性E. coli O1菌种接种到培养基上，37 ℃温箱中培养24 h。制作营养肉汤培养基，将形态良好的菌落接种到营养肉汤培养基中，37 ℃恒温摇床中培养18 h。用伊红美兰培养基检测菌株是否为大肠杆菌。制成菌悬液放入4 ℃冰箱保存。1.2.2试验设计试验采用单因素试验设计，18头牛随机分为6组，包括健康组（NC组）、腹泻组（EC组）、抗生素组（CIP组）、BSEIC低剂量组（BSEIC-L组）、BSEIC中剂量组（BSEIC-M组）、BSEIC高剂量组（BSEIC-H组），每组3头，每天两次（6：00、17：00）混入牛奶给药。试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.013.T001表1试验设计组别给药方案NC组口服无菌生理盐水，2次/d，共7 dEC组口服无菌生理盐水，2次/d，共7 d（第5 d晨饲前口服给菌）CIP组口服0.05 g/kg环丙沙星，2次/d，共7 d（第5 d晨饲前口服给菌）BSEIC-L组口服1.25 g/kg BSEIC，2次/d，共7 d（第5 d晨饲前口服给菌）BSEIC-M组口服2.50 g/kg BSEIC，2次/d，共7 d（第5 d晨饲前口服给菌）BSEIC-H组口服5.00 g/kg BSEIC，2次/d，共7 d（第5 d晨饲前口服给菌）注：致病性E. coli O1（2.50×1011 CFU/mL，100 mL/头）。1.3测定指标及方法1.3.1样品采集试验第7 d，末次给药1 h后，处死犊牛，采血，分离血清；采集小肠组织，用生理盐水轻轻冲洗内容物，一部分放入福尔马林中固定，另一部分放入液氮速冻后放入-80 ℃冰箱保存。1.3.2血液和肠组织中相关因子含量ELISA法测定血清中二胺氧化酶（DAO）活性、D-乳酸（D-LA）含量，测定十二指肠中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，总抗氧化能力（T-AOC）以及白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子-β（TGF-β）、白细胞介素-1β（IL-1β）的含量。试验方法参考试剂盒说明书。1.3.3PAS染色用镊子拿出固定好的肠组织，修块、冲洗、脱水透明，浸蜡包埋。将包埋好的组织进行切片，烤片，用二甲苯和梯度酒精脱蜡，1%高碘酸浸泡10 min，再蒸馏水洗。放入雪夫试剂5 min，再用蒸馏水清洗；放入亚硫酸 2 min，再用蒸馏水清洗；苏木素复染10 min，再用蒸馏水清洗。切片使用无水乙醇脱水，二甲苯透明，显微镜下观察。1.4数据统计与分析采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1BSEIC对犊牛十二指肠抗氧化指标的影响（见表2）由表2可知，给药7 d后，与NC组相比，EC组犊牛十二指肠中SOD活性显著降低（P0.05），CAT、GSH-Px活性和T-AOC均极显著降低（P0.01），MDA含量极显著升高（P0.01）。与EC组相比，BSEIC-M组犊牛十二指肠中CAT、GSH-Px和SOD的活性和T-AOC显著升高（P0.05）；BSEIC-M组犊牛十二指肠MDA含量极显著降低（P0.01）；BSEIC-H组犊牛十二指肠MDA含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.013.T002表2BSEIC对犊牛十二指肠抗氧化指标的影响组别CAT/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)MDA/(μmol/L)SOD/(U/mL)T-AOC/(U/mL)NC组147.99±9.45a128.75±3.70a11.23±0.74c227.26±8.04a27.61±0.28aEC组124.87±4.25c98.66±6.91c14.93±0.15a189.48±4.02b23.65±0.18cCIP组140.28±3.74ab109.46±8.98bc13.97±0.47ab212.44±20.84ab25.59±0.98bBSEIC-L组138.24±8.75ab116.71±3.70ab14.41±0.51a195.59±9.53b25.64±1.18bBSEIC-M组139.97±13.72ab121.19±8.57ab11.36±0.62c232.07±18.18a26.30±0.42abBSEIC-H组127.39±1.19c107.92±10.65bc12.92±1.08b208.37±9.03ab25.20±1.47bc注：同列数据肩标相邻字母表示差异显著（P0.05），相间字母表示差异极显著（P0.01）；表3、表4与此同。2.2BSEIC对犊牛十二指肠免疫因子的影响（见表3）由表3可知，与NC组相比，EC组犊牛十二指肠IL-2、IL-4和IL-10含量极显著下降（P0.01）。与EC组相比，CIP组、BSEIC-L组和BSEIC-H组犊牛十二指肠IL-2、IL-10含量显著升高（P0.05），BSEIC-M组犊牛十二指肠IL-2含量极显著升高（P0.01），BSEIC-M组犊牛十二指肠IL-4、IL-10含量显著升高（P0.05）。与NC组相比，EC组犊牛十二指肠中IFN-γ、TGF-β含量极显著升高（P0.01），TNF-α、IL-1β含量显著升高（P0.05）。与EC组相比，BSEIC-M组犊牛十二指肠中IFN-γ、TNF-α、TGF-β和IL-1β含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.013.T003表3BSEIC对犊牛十二指肠免疫因子的影响组别IL-2IL-4IL-10IFN-γTNF-αTGF-βIL-1βNC组1 004.24±22.49a71.44±5.44a168.43±10.28a1 389.25±80.35c146.79±3.53b765.92±39.48c526.20±22.17bEC组795.33±30.38d59.99±3.23c88.43±6.92c1 678.95±47.86a174.82±14.69a881.46±64.76a590.48±15.44aCIP组902.27±26.99bc63.24±3.39bc135.16±6.80b1 539.47±71.59abc155.40±11.94b791.13±57.84bc551.38±39.76abBSEIC-L组868.69±80.47c60.33±2.62c138.90±11.39b1 622.24±158.79ab150.64±10.31b803.74±41.20abc571.26±32.00abBSEIC-M组966.93±26.99ab69.54±3.66ab142.26±4.36b1 470.49±103.47bc148.63±4.15b789.03±34.85bc530.17±6.39bBSEIC-H组920.92±18.40bc64.33±1.52bc150.49±3.29b1 588.52±108.14ab154.67±9.58b874.11±23.86ab573.25±15.01abng/L2.3BSEIC对犊牛血清中DAO活性和D-LA含量的影响（见表4）由表4可知，给药7 d后，与NC组相比，EC组犊牛血清中DAO活性极显著升高（P0.01），D-LA含量显著升高（P0.05）。与EC组相比，各用药组犊牛血清中DAO活性、D-LA含量均显著降低（P0.05）。各蒙兽药巴特尔-7有效成分复方各剂量组犊牛血清中DAO活性均显著高于NC组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.013.T004表4BSEIC对犊牛血清中DAO活性和D-LA含量的影响组别DAO/(U/mL)D-LA/(µmol/L)NC组17.96±0.33c37.43±3.52bEC组24.80±1.64a46.02±2.48aCIP组19.87±1.17b39.67±3.38bBSEIC-L组20.25.±0.35b38.87±1.93bBSEIC-M组20.58±1.10b37.79±1.71bBSEIC-H组21.73±1.08b35.79±1.72b2.4BSEIC对犊牛十二指肠杯状细胞数量的影响（见表5、图1）由表5可知，EC组犊牛十二指肠杯状细胞数极显著低于NC组（P0.01）；与EC组相比，BSEIC-M组犊牛十二指肠杯状细胞数量极显著升高（P0.01），BSEIC-L组、BSEIC-H组犊牛十二指肠杯状细胞数量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.013.T005表5BSEIC对犊牛十二指肠杯状细胞数量的影响项目NC组EC组CIP组BSEIC-L组BSEIC-M组BSEIC-H组杯状细胞数量306.67±25.66a63.33±7.63d184.67±13.05b107.67±9.29c207.67±15.53b121.33±8.08c注：同行数据肩标相邻字母表示差异显著（P0.05），相间字母表示差异极显著（P0.01）。由图1（a）可知，NC组犊牛肠绒毛结构完整，排列整齐、紧密，杯状细胞分布密集。由图1（b）可知，EC组犊牛肠绒毛脱落、肠绒毛间隙增大，杯状细胞分布稀疏。由图1（c）可知，相对EC组，CIP组犊牛肠绒毛形态得到一定程度的恢复，肠绒毛排列相对整齐，杯状细胞增多。由图1（d）、图1（e）、图1（f）可知，BSEIC-L组、BSEIC-M组、BSEIC-H组犊牛肠绒毛均得到不同程度的恢复，肠绒毛间隙缩小，杯状细胞增多，其中BSEIC-M组效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.013.F001图1十二指肠PAS染色结果（200×）3讨论3.1BSEIC对犊牛十二指肠抗氧化指标的影响氧化应激是肠道屏障功能受损的重要因素之一。当有害刺激刺激机体时，会打破机体的氧化和抗氧化的动态平衡，产生大量的活性氧自由基等物质，从而对生物大分子活性、细胞结构产生严重的破坏，引起复杂的生理或病理损伤过程[9]。氧化应激的程度可以用T-AOC和抗氧化酶（GSH-Px、CAT和SOD等）活性评价。其中，SOD和GSH-Px可清除活性氧，发挥抗氧化剂的作用。MDA含量间接反映机体组织过氧化损伤的程度。枸杞多糖可提高肉鸡血清和肝脏中SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量[10]。本试验结果显示，EC组犊牛十二指肠T-AOC和抗氧化酶（GSH-Px、CAT和SOD）的活性显著降低，MDA含量显著升高；而蒙兽药巴特尔-7有效成分复方可以显著提高犊牛十二指肠T-AOC和抗氧化酶（GSH-Px、CAT和SOD）活性，降低MDA含量，表明蒙兽药巴特尔-7有效成分复方能够增强机体抗氧化功能。3.2BSEIC对犊牛十二指肠免疫因子的影响肠黏膜免疫的稳态需要多种细胞免疫因子的参与。炎症因子包括白细胞介素和细胞因子，具有双向免疫调节维持免疫稳态的作用[11]。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，可促进T细胞的成熟和分化。IFN-γ作为促炎因子，能够与多种致炎因子相互作用，还可抑制Th2相关细胞因子分泌，从而导致炎症加剧[12]。TNF-α作为炎症反应细胞因子，可诱导产生IL-1、IL-6等炎性因子，诱发炎症反应并启动炎症级联反应[13]。IL-1β作为炎性反应介质，组织受损后，炎症部位的浓度会升高，还诱导其他促炎因子释放，使炎症反应加重[14]。TGF-β在发育、炎症和免疫等方面起到关键作用[15]。IL-2可促进淋巴细胞的生长、增殖与分化，其含量可反映机体的免疫应答能力[16]。研究显示，日粮中添加硒代蛋氨酸可降低热应激肉鸡IL-1β含量，升高IL-2含量[16]。Th2细胞主要产生IL-4、IL-10等细胞因子[17]。IL-4作为重要抗炎因子，能够抑制TNF-α产生，调节各种淋巴细胞所分泌的细胞因子[18]。研究显示，改良冲和膏可有效降低糖尿病溃疡大鼠的IFN-γ含量，升高IL-4含量[12]。IL-10能够抑制Th1细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子，增强抗炎作用[19]。半夏泻心汤可以升高DSS-UC模型小鼠血清及结肠组织中IL-10含量，降低血清及结肠组织中TNF-α含量，进而改善组织损伤情况[18]。温阳解毒化瘀方可能通过增加IL-10/STAT3表达，减轻炎症反应[20]。本研究结果显示，与NC组相比，EC组犊牛十二指肠中IL-4、IL-2和IL-10的含量显著下降，十二指肠中炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6含量提高，表明E. coli O1可导致腹泻犊牛的肠黏膜免疫稳态失调，加剧炎症反应。经过蒙兽药巴特尔-7有效成分复方的治疗，犊牛十二指肠IL-4、IL-2和IL-10含量提高，IFN-γ、TNF-α、TGF-β和IL-1β含量下降，且与CIP组无显著差异，表明蒙兽药巴特尔-7有效成分复方可通过维持免疫因子、抗炎因子和炎症因子的平衡，增强犊牛机体的免疫抗炎能力。3.3BSEIC对犊牛血清中DAO活性和D-LA含量的影响DAO和D-LA均是评价肠黏膜功能的较敏感指标[17]，肠黏膜受损后其数值显著升高。DAO通常存在于肠黏膜和绒毛中，是分解代谢途径的一种酶，在缺血、缺氧或脓毒症时可释放到循环中，其浓度与肠黏膜完整性呈正相关。D-LA由几种类型的细菌产生，其浓度增加表明肠壁的渗透性增加或细菌繁殖水平升高[21]，常用于评估肠道屏障损伤程度。研究发现，清热愈疡汤可抑制溃疡性结肠炎患者血清DAO活性和D-LA含量升高[17]。本研究结果显示，蒙兽药巴特尔-7效成分复方各剂量组犊牛血清中DAO活性和D-LA含量均低于EC组，表明蒙兽药巴特尔-7效成分复方可促进腹泻犊牛肠黏膜损伤的恢复，提高肠道免疫机制，具有维持肠道内环境的作用。3.4BSEIC对犊牛十二指肠杯状细胞数量的影响肠上皮细胞是肠道物理屏障防御的关键，杯状细胞是肠上皮细胞的主要细胞，当肠道受到刺激时，杯状细胞会分泌黏蛋白和一些其他活性物质，形成黏液屏障，为保护肠道提供了保障[22]，其数量的减少或功能受损均可导致黏膜屏障功能受损。研究发现，葡聚糖硫酸钠小鼠肠炎模型中肠上皮杯状细胞数量大大减少[23]。黄芪多糖可显著增加肠炎雏鸡中肠上皮杯状细胞的数量[24]。本试验结果显示，EC组犊牛十二指肠杯状细胞数极显著低于NC组；与EC组相比，BSEIC-M组、BSEIC-L组、BSEIC-H组犊牛十二指肠杯状细胞数量均有所升高。研究表明，蒙兽药巴特尔-7有效成分复方可通过促进肠道上皮更新增加杯状细胞数量，提高肠道屏障功能，起预防犊牛腹泻的作用。4结论本研究结果表明，蒙兽药巴特尔-7有效成分复方对免疫应答、免疫相关因子具有调节作用，能够保护肠黏膜通透性，加强肠道屏障的保护功能。其中，中剂量组（2.50 g/kg）效果最佳。