腹泻是危害畜牧养殖经济效益的主要疾病之一，也是许多动物疾病的临床表现之一，如非洲猪瘟、流感、新城疫、牛病毒性腹泻以及仔畜消化不良等。因此，开发治疗畜禽腹泻的药物刻不容缓。炎症性肠病（IBD）是发生于肠道的慢性肠炎病。溃疡性结肠炎（UC）属于一种IBD，患病动物会出现腹泻、血便、体重减轻、精神不振、食欲减退、发热等症状[1]。UC发生后，肠道黏膜屏障以及肠绒毛结构被破坏，炎性细胞聚集，释放出大量促炎因子如白细胞介素1-1β（IL-1β）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）等，导致肠道炎症的持续发展。IL-10在抗炎以及调节免疫耐受性中发挥关键作用，可以阻止促炎细胞因子产生，下调炎症中心的浸润性免疫细胞的增殖[2]。肠道内黏膜主要由杯状细胞分泌形成，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）可作为激活信号，使肠道内杯状细胞分泌黏液，从而形成或修补黏膜屏障[3]。体内蓄积过多的髓过氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA）会降低机体免疫力，破坏各种屏障结构，加速炎症发展；机体内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及超氧化物歧化酶（SOD）也可在一定程度上减轻炎症。本课题组前期试验证明，由蒲公英、紫花地丁、王不留行为君药，当归、瓜蒌、路路通为臣药，白术、白芍、柴胡为佐药，甘草为使药配伍而成的中草药（等比例）提取物具有广泛的抗炎作用[4]。基于此，本研究从炎症调节角度出发，通过葡聚糖硫酸钠（DSS）制备的小鼠UC模型探究该中草药提取物对小鼠UC模型的调节作用及可能的作用机制。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物60只SPF级昆明小鼠，雄性，7~9周龄，体重（20±2）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。1.1.2试验药物及试剂中草药方剂中各味中草药均购自石河子市子午路大药房；DSS（MW：36 000~50 000 Da，批号：S14048）、柳氮磺吡啶（SASP，批号：S80823）、苏木素伊红（HE）染色液（批号：R20570）均购自上海源叶生物科技有限公司；小鼠白细胞介素-10（IL-10）、IL-1β、TNF-α、IL-17、PPAR-γ、IFN-γ、MPO、MDA、SOD以及GSH-Px ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。1.1.3试验仪器RE52CS-2型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），精密电子天平（北京赛多利斯公司），202型电热恒温干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂），1510型全波长酶标仪（序列号：1510-02980C，Thermo Fisher公司），HVA-85高压蒸汽灭菌锅（华粤行仪器有限公司），ZG-280中药煎药包装一体机（吉首市中诚制药机械厂），CMP-HP-20L纯水仪（成都优越科技有限公司），SORVALL LEGEBD MICRO 21高速离心机（美国TheomoFisher公司）；10、50、100 μL移液枪（德国Transferpette公司）。1.2中草药提取物制备将500 g配伍好的中草药方剂用5 L蒸馏水浸泡2~3 h，待药液颜色明显变化后使用自动煎药机煎煮，武火煮沸后文火继续煎煮1.5 h，待药液冷却至室温后盛出；在剩余药渣中再加入4 L蒸馏水，操作步骤同上。将两次药液合并，用旋转蒸发仪将其浓缩至2 g/mL。按比例配制高（1.6 g/mL）、中（0.8 g/mL）、低（0.4 g/mL）浓度的中草药提取物[4]。1.3小鼠UC模型建立参照Wang等[5]造模方法，将3%的DSS溶液替代无菌蒸馏水饲喂已预饲1 w的小鼠，连续7 d，每天更换新的DSS溶液，造模结束后更换为无菌蒸馏水。造模期间每天记录小鼠体重以及疾病活动指数（DAI），根据小鼠DAI指数以及结肠长度判断是否造模成功，其中DAI≥3级模型组结肠长度与空白组结肠长度有显著差异确定建模成功。1.4试验设计随机挑选未造模且身体健康昆明小鼠10只为空白组（BC）；另外挑选50只造模成功小鼠随机分为模型组（Model）、阳性组（SASP，0.45 mg/g）、中草药提取物高剂量组（ZY-H，16 mg/g）、中草药提取物中剂量组（ZY-M，8 mg/g）、中草药提取物低剂量组（ZY-L，4 mg/g）；ZY组每天固定时间灌服各剂量中草药提取物，SASP组灌服浓度为0.045 g/mL的SASP溶液，BC组及Model组灌服等体积无菌生理盐水。造模后，连续给药10 d，每天1次，试验期间各组小鼠自由饮食饮水。1.5测定指标及方法1.5.1一般情况观察观察并记录造模及给药期间各组小鼠精神状态、被毛情况、眼窝凹陷程度、粪便性状、粪便隐血。每天对小鼠进行称重，计算体质量变化率。1.5.2DAI评分从体质量下降百分数、粪便黏稠度、粪便出血情况3个方面综合评估小鼠DAI指数，每组评估9只。DAI评分指标[6]见表1。DAI评分=(体质量下降分数+粪便黏稠度分数+粪便出血分数)/3(1)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.T001表1DAI评分指标评分体质量下降百分数/%粪便黏稠度粪便出血0—正常—11~5松软隐血阳性25~10310~15腹泻显性出血4＞151.5.3小鼠结肠组织病理切片及评分[7]（见表2）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.T002表2小鼠结肠组织病理学评分评分病变深度炎症程度隐窝破坏病变范围/%0无无无—1黏膜层轻度基底1/3隐窝被破坏1~252黏膜与黏膜下层中度基底2/3隐窝被破坏26~503肌层重度仅表面上皮完整51~754浆膜层—全部隐窝和上皮被破坏76~100小鼠第16 d灌胃结束开始禁食，在第17 d灌胃结束2 h后处死。取鼠结肠组织，用生理盐水将肠腔冲洗干净，置于10%福尔马林溶液中固定至少24 h。按步骤对结肠组织脱水、透明、透蜡、切片、HE染色。光学显微镜观察各组组织。每组随机挑选5只小鼠进行病理学评分，每只小鼠的结肠组织切片随机观察3个不同视野。1.5.4小鼠结肠组织中细胞因子含量检测试验期满，处死小鼠并迅速冲洗结肠肠腔，并取约0.1 g结肠组织置于液氮保存。每组随机挑取5只小鼠的结肠组织，检测前按质量比结肠组织∶PBS=1∶9匀浆；制备好的匀浆液3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用ELISA试剂盒检测小鼠IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-17、PPAR-γ、IFN-γ、MPO、MDA、SOD以及GSH-Px等指标，每只小鼠3个重复具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。1.6数据统计与分析试验数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，组间比较选用单因素方差检验，假定方差齐性用LSD检验，未假定方差齐性用邓尼特T3检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1小鼠一般状况及急性UC模型评价BC组小鼠反应敏捷、被毛光滑、大便成形、饮水饮食正常，至试验结束无死亡情况，且体格明显增长。造模小鼠在饮用3% DSS溶液第1、2 d，采食饮食无明显异常，精神较好，大便成形；造模第3 d，部分小鼠出现精神沉郁、被毛粗乱症状、粪便颜色变深，且采食量略有下降；造模第4 d，小鼠扎堆且蜷缩于角落、不喜动、精神沉郁眼窝凹陷、被毛粗糙站立、粪便恶臭黏稠，黏于鼠笼壁，部分有血样腹泻；第5 d直至造模周期结束，小鼠精神状态极差，极度消瘦，体表温度下降，部分小鼠死亡，水样粪便，恶臭黑色或棕红色。造模期间每日对小鼠体重及DAI指数进行记录，小鼠体质量变化率及DAI指数见图1。造模完成后测量各组小鼠的结肠长度，见图2。图1小鼠体质量变化率及DAI指数注：与BC组相比，“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）；与Model组相比，“#”表示差异显著（P0.05），“##”表示差异极显著（P0.01）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F1a1（a）体质量变化率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F1a2（b）DAI指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F002图2小鼠结肠长度变化由图1、图2可知，与BC组相比，Model组小鼠体质量变化率及结肠长度极显著降低（P0.01），且DAI指数均大于3，符合急性UC造模标准。造模过程中，ZY-H组及Model组各死亡1只小鼠，其余各组无死亡情况。试验时，为保证各组小鼠数量一致，遵循控制变量的原则，各组小鼠数量均以ZY-H组及Model组小鼠数量为准，剔除其余组多余小鼠，保证每组9只。2.2中草药提取物对小鼠体重及DAI的影响（见图1）由图1（a）可知，给予急性UC小鼠中草药提取物可有效缓解小鼠体重下降趋势。与BC组相比，Model组小鼠体质量变化率极显著降低（P0.01）；与Model组相比，ZY-H组、ZY-M组、ZY-L组以及SASP组小鼠体质量变化率均极显著升高（P0.01），表明各剂量中草药提取物均可极显著改善小鼠体质量变化率，对小鼠体重下降趋势具有正向调节作用。由图1（b）可知，与Model组相比，各药物处理组小鼠DAI指数均极显著降低（P0.01），表明中草药提取物可有效改善DSS诱导的小鼠UC模型DAI指数，缓解疾病症状。2.3中草药提取物对小鼠结肠组织HE染色结果的影响（见图3）由图3可知，BC组小鼠结肠组织固有层内有大量隐窝，呈直管状，排列密集，含大量杯状细胞和少量柱状细胞，固有层的结缔组织内可见许多浆细胞，黏膜下层结缔组织疏松，肌层结构清晰，未见明显的病理改变。Model组小鼠结肠黏膜缺损，固有层隐窝排列异常，杯状细胞明显减少，固有层底部可见大量淋巴细胞浸润，炎性细胞浸润到黏膜下层。SASP组及ZY组小鼠结肠组织形态较Model组有明显改善，可见少量黏膜上皮细胞脱落，固有层隐窝排列密集未见异常，杯状细胞丰富；其中SASP组及ZY-H组固有层底部可见少量的淋巴细胞浸润，ZY-M组固有层底部可见中量的淋巴细胞浸润，ZY-L组固有层底部可见中量淋巴细胞浸润，炎性细胞浸润到黏膜下层。各剂量中草药提取物均可有效缓解小鼠结肠组织的病理情况，改善小鼠结肠组织的形态结构，减轻小鼠结肠黏膜损伤以及固有层的炎性细胞浸润程度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F003图3中草药提取物对小鼠结肠组织HE染色结果的影响（200×）2.4中草药提取物对小鼠结肠组织病理学评分的影响（见图4）由图4可知，与BC组相比，Model组小鼠结肠组织病理学评分极显著升高（P0.01），表明小鼠UC模型造模成功。与Model组相比，SASP组以及ZY各剂量组小鼠结肠组织病理学评分均极显著降低（P0.01），表明ZY可降低由DSS诱导的小鼠UC模型结肠组织的高病理学评分。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F004图4中草药提取物对小鼠结肠组织病理学评分的影响2.5中草药提取物对各组小鼠结肠组织细胞因子含量的影响（见图5）由图5可知，与BC组相比，Model组小鼠结肠TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ、MPO、MDA含量极显著升高（P0.01），IL-10、PPAR-γ的含量及SOD、GSH-Px的活性极显著降低（P0.01）。与Model组相比，ZY各剂量组及SASP组细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ、MPO、MDA含量极显著降低（P0.01），IL-10、PPAR-γ的含量及SOD、GSH-Px活性极显著升高（P0.01）。图5中草药提取物对各组小鼠结肠组织细胞因子含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a1（a）TNF-α含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a2（b）IL-1β含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a3（c）IL-17含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a4（d）IL-10含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a5（e）IFN-γ含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a6（f）PPAR-γ含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a7（g）MPO含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a8（h）MDA含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5a9（i）SOD含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.014.F5b1（j）GSH-Px含量3讨论畜牧养殖业中，可以引起畜禽腹泻的疾病会严重影响其生产产值。在研究治疗畜牧动物腹泻类疾病药物过程中，溃疡性结肠炎模型是较为普遍的研究模型[6]。UC是一种影响结肠的高发性炎症疾病，随着疾病进程发展会引起肠道更深层次的炎症，且有可能诱发结肠癌[8]。虽然UC的发病机制尚无统一定论，但目前普遍认为该病的发生与遗传、免疫调节和环境因素密切相关[9]。腹泻、体重减轻、腹痛、直肠出血和呕吐是UC的主要临床症状。目前，临床中常用抗炎药、免疫抑制剂、TNF-α拮抗剂疗法以及联生物疗法治疗UC[10]。但由于上述治疗存在副作用以及费用较高，无法达到令人满意的效果[11]；如5-氨基水杨酸（5-ASA）和免疫抑制剂虽然对UC治疗具有一定效果，但仍可引起头痛、腹泻、过敏反应、肾毒性和生殖毒性[12]。临床中应用补充和替代医学（complementary and alternative medicine，CAM）治疗UC趋于流行，CAM在IBD的治疗中发挥了比较重要的作用[13]。中药是CAM中很强大的分支，在临床中也具有很好的疗效。因此，本课题组在前期试验的基础上，研究以蒲公英、王不留行、紫花地丁、甘草等多味中草药配伍而成的中草药方剂的水提物对小鼠UC模型的调节作用，以期探究中药的多种功效以及开发治疗UC的新型中药方剂。3.1中草药提取物对UC小鼠模型DAI指数的影响本试验结果显示，SASP及各剂量ZY对UC小鼠模型体质量变化率以及DAI指数均具有显著的改善作用。研究表明，蒲公英、王不留行、紫花地丁、甘草在治疗DSS诱导的小鼠UC模型均具有一定效果，可改善UC小鼠模型体重下降趋势以及DAI指数[14-20]，与本试验结果趋势一致，表明中药提取物可以缓解UC小鼠模型的临床表征。3.2中草药提取物对UC小鼠模型结肠组织中炎性相关细胞因子的影响UC的发病机制与多种因素相关。其中，促炎细胞因子含量异常升高、氧化应激、肠道黏膜屏障损坏及肠道菌群失衡为主要原因[16]。中药可以通过改善结肠组织炎性相关细胞因子、抑制相关炎症信号通路达到治疗UC目的。Ding等[17]研究发现，蒲公英水提物可显著降低小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MDA含量，提高结肠组织中SOD活性，从而减轻小鼠结肠细胞的氧化损伤，缓解炎症进程；蒲公英水提物可能通过抑制NF-κB信号通路减轻DSS诱导的小鼠结肠炎。前人研究显示，甘草具有的抗炎效果较强，对多种炎症均具有显著的抑制作用[18]。Huang等[19]发现，甘草多糖可减轻DSS诱导小鼠UC模型的肠道通透性，降低血清炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α含量，提高血清抗炎因子IL-10含量，提示甘草多糖治疗UC的机制与降低肠道通透性、抑制炎症反应有关，其中减轻肠通透性是其启动机制之一。本试验研究结果显示，中药提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎具有正向调节作用。通过观察UC小鼠结肠组织切片发现，各剂量中药提取物均可缓解结肠组织中细胞浸润程度，降低病理学评分，改善结肠绒毛及肠隐窝结构的破坏程度，具有保护结肠完整性的作用。本试验细胞因子检测结果显示，中药提取物下调了结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ含量，以ZY-H组效果最佳。TNF-α、IL-1β在各种类型的炎症中均具有放大炎症反应、加速炎症发展的作用。最近，研究表明，IFN-γ与TNF-α具有协同作用，其通过β-连环蛋白信号通路抑制结肠上皮细胞增殖并促进其凋亡，从而加剧炎症[20]。Walrath等[20]发现，IFN-γ与IL-17A可以促使结肠隐窝释放趋化因子CXCL10，从而募集中心粒细胞，加大了对结肠上皮细胞的损害，增加了结肠通透性。IL-17是一种由CD4+细胞亚群Th17细胞产生的细胞因子，在免疫性疾病中起重要作用。在结肠中，抗原物质与抗原呈递细胞上的Toll样受体结合，促进IL-23释放，随之诱导Th-17细胞扩增，导致IL-17释放；IL-17刺激结肠上皮细胞分泌IL-6和IL-8，并上调结肠内皮细胞上的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达。由于IL-8是一种趋化因子，中性粒细胞被吸引到该部位并释放炎症介质，从而导致炎症性肠病中的上皮细胞损伤[21]。本试验中，Model组小鼠结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-17含量显著升高，表明Model组小鼠结肠已发生严重的炎症反应，SASP及各剂量中药提取物均可改善各细胞因子异常变化，趋于恢复平衡，减轻了炎症发展程度。由此推测，中药提取物可能是通过恢复炎性因子之间的平衡缓解UC症状。3.3中草药提取物对UC小鼠模型结肠组织中氧化及抗氧化相关酶的影响MPO、MDA均为体内对机体危害比较大的氧化应激物。MPO主要存在于中性粒细胞和单核细胞的初级嗜天青颗粒中，是中性粒细胞功能及活性激活的标志，在一定程度上可反映组织中中性粒细胞浸润程度。MPO以过氧化氢（H2O2）和氯离子（Cl-）为底物，产生一种高度有害的物质次氯酸（HClO），由此破坏组织及细胞结构[22]。MDA则是机体内氧自由基参与脂质过氧化反应的产物，同样也对组织及细胞具有破坏作用[23]。SOD与GSH-Px是体内抗氧化物的代表。SOD是体内氧自由基的清除剂，可减少因氧自由基参与脂质过氧化物反应产生的MDA，从而保护组织及细胞结构和功能的完整性；还原性谷胱甘肽（GSH）是体内主要的细胞内低分子量硫醇，在发生亲电/氧化性组织损伤时GSH充当抗氧化剂，GSH是最强大的细胞内抗氧化剂，通过谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和GSH-Px的催化作用，在多种亲电子化合物和过氧化物的解毒中发挥作用[24-25]。本研究中，Model组小鼠结肠组织中MPO、MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px活性显著下降，可见Model组小鼠结肠发生了严重的氧化应激。各治疗组MPO、MDA含量显著低于Model组，SOD、GSH-Px活性显著高于Model组，表明中药提取物可保护由DSS诱导的小鼠UC模型的结肠组织氧化损伤，提示中药提取物可能通过抗氧化的方式保护结肠组织结构的完整性缓解UC症状。此外，黏液层的损坏也是诱发结肠炎的关键因素。3.4中草药提取物对UC小鼠模型结肠组织中IL-10与PPAR-γ的影响IL-10是一种由单核巨噬细胞和Th2细胞分泌的抑炎因子，可以抑制各种炎性细胞产生促炎因子（如TNF-α、IFN-γ），且IL-10的相对或绝对缺乏是引起IBD的主要原因[26]。PPARγ是一种可激活肠道内杯状细胞分泌黏液从而达到形成或修补黏膜屏障的信号分子。研究显示，PPARγ在调节以及修复肠道损伤过程中具有重要作用[27]。IL-10缺乏小鼠的肠道炎症与细菌高渗透性的形态学分层的黏液层有关，且PPAR-γ的磷酸化作用可调节先天免疫调节剂IL-10的转录激活，之后IL-10与巨噬细胞表达的IL-10受体结合，并使巨噬细胞极化为抗炎表型，即CX3CRhi。这些巨噬细胞将肠道免疫强度控制在合理范围内，既可避免肠道受到病原微生物入侵，还可以维持肠道微生物的菌群平衡[27-28]。同时，PPAR-γ可以作用于肠道杯状细胞，刺激其分泌黏液，维持肠道黏液层的完整性，溶解并排出侵入肠道中的病原微生物[29-30]。本试验发现，Model组小鼠结肠组织中PPAR-γ、IL-10含量明显低于BC组，表明Model组小鼠结肠黏膜屏障完整性及修复功能受到损坏和抑制，黏膜免疫功能也在一定程度上下降；ZY各处理组和SASP组小鼠结肠组织中PPAR-γ、IL-10含量均显著高于Model组，与BC组相比虽然存在一定差异，但UC小鼠的各种症状也得到了改善，表明中药提取物可改善UC小鼠结肠组织中PPAR-γ、IL-10含量，恢复肠道黏膜免疫功能。4结论本试验结果显示，中草药提取物可改善由DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎所引起的临床症状，恢复结肠完整性，降低结肠组织病理学评分，缓解炎症反应及氧化应激。其作用机制可能与降低结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ和氧化应激物MPO、MDA含量，改善抑炎因子IL-10，抗氧化相关酶SOD与GSH-Px活性以及PPARγ的含量有关。但由于体内各种细胞因子存在错综复杂且密不可分的关系，因此中草药提取物对DSS诱导的小鼠UC模型治疗作用的具体作用机制还有待进一步研究。