我国水产养殖规模逐渐扩大并日趋集约化，产量提升的同时水体中积存大量的残饵、水生物排泄物等有机物，导致养殖废水污染问题愈加严重[1-2]。同时，集约化养殖、大量投饵造成水体亚硝酸盐含量高，会直接危害水产动物机体健康。养殖废水处理不当会制约我国水产养殖业的发展[3-6]，因此，高效、便捷、低成本地处理养殖废水是保证水产养殖业可持续发展的关键。光合细菌可降解水体中亚硝酸盐、氨氮、硫化物等，具有调水稳水的作用[7]。刘洋等[8]研究表明，光合细菌可有效去除污水中的硝酸盐和氨氮。Fan等[9]研究了光合细菌处理废水至符合国家排放标准的方法。光合细菌菌体本身无毒害、营养丰富，可作为饲料添加剂促进动物生长，将光合细菌拌喂乌鳢，可提升乌鳢的食用口感及营养价值[10-11]。养殖水产品的多样性、冬棚南美白对虾的养殖及养殖水温跃层现象等对光合细菌的作用温度提出了进一步要求[12-14]。我国海洋资源丰富，海水养殖面积日渐扩大，但目前全球77%的养殖水产品仍来自淡水养殖，海水与淡水养殖的差异对光合细菌提出了进一步的要求[15]。为开发利用光合细菌，需扩增光合细菌以满足工厂实际生产需求。本研究致力于筛选耐盐、耐低温、可调水的光合细菌并扩培，为水产养殖业更好发展及光合细菌在水产养殖业的实际应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1富集培养基[16]初始发酵培养基：蛋白胨0.3 g、酵母粉0.5 g、NH4Cl 1 g、NaCl 1 g、C2H3O2Na·3H2O 1 g、二水合丁二酸钠1 g、KH2PO4 0.5 g、MgCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2 0.1 g、蒸馏水1 L，pH值7.0。亚硝氮培养基：亚硝酸溶液（2.5 g/L）50 μL、大北农金贝虾苗宝虾料0.05 g、蒸馏水 50 mL，121 ℃灭菌20 min。1.1.2样品采集与富集样品采集与富集参考王雨婷等[17]的试验方法。1.2试验方法1.2.1光合细菌的分离纯化从变色的厌氧管中取1 mL，梯度稀释涂布于固体富集培养基，30 ℃、1 000~2 000 lx光照厌氧培养3~7 d。挑取红色单菌落，纯化至显微镜下菌体形态一致[17]。1.2.2光合细菌菌株的确定1.2.2.1形态学观察观察菌落形态，挑取菌落进行革兰氏染色并在光学显微镜下镜检[18]。1.2.2.216S rRNA鉴定细菌对的16S rRNA鉴定参考文献[19]方法进行鉴定。1.2.3亚硝酸盐降解试验1.2.3.1标准曲线制作配制0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mg/L的亚硝酸钠样液，吸取不同浓度样液200 μL，依次加入格里斯A、B试剂各20 μL，测定OD550 nm值，制作标准曲线[16]。1.2.3.2亚硝态氮测定取50 μL菌液接种到50 mL亚硝氮培养基中，分别置于30 °C光照与30 °C无光照培养箱，取24、48 h的样品，12 000 r/min离心3 min取上清液，依次加入格里斯A、B试剂各20 μL，测量OD550 nm值，并代入标准曲线计算对应亚硝酸含量，计算亚硝降解率[16]。亚硝降解率=(CK亚硝酸盐含量-处理组亚硝酸盐含量)/CK亚硝酸盐含量×100%(1)1.2.4耐盐度测试挑取菌株接入初始发酵培养基，30 ℃、1 000~2 000 lx光照培养5 d作为种子液。采用盐度计调整初始发酵培养基盐度分别为5、15、25、35，121 ℃ 15 min高温高压灭菌。以5%接种量分别接入不同盐度的100 mL无菌培养基，30 ℃、1 000~2 000 lx光照培养5 d，测OD660 nm值[20]。由耐盐度及亚硝酸盐降解率选择菌株DBNRh06进行进一步研究。1.2.5不同温度下DBNRh06亚硝酸盐降解率取50 μL菌液接入50 mL亚硝氮培养基中，分别置入15、20、25 ℃培养箱，取24、48、72、96 h的样品，12 000 r/min离心3 min，取上清液，依次加入格里斯A、B试剂各20 μL，测量OD550 nm值，将OD550 nm值代入标准曲线计算对应的亚硝酸含量和亚硝降解率[21]。1.3单因素试验1.3.1不同碳源对DBNRh06生长特性的影响分别以乙酸钠、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、苹果酸、碳酸氢钠作为碳源替换初始发酵培养基碳源并以1 g/L添加。接种量为2%光照厌氧培养96 h测OD660 nm值。选择最佳碳源并配制浓度为0.6、0.8、1.0、3.0、5.0、7.0 g/L进行进一步试验。1.3.2不同氮源对DBNRh06生长特性的影响将初始发酵培养基中的氮源以草酸铵、乙酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酸钠、尿素、作为氮源按照1 g/L的含量替换添加。接种量为2%光照厌氧培养96 h测OD660 nm值。选择最佳氮源并配制浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%进行进一步试验。1.3.3不同生长因子对DBNRh06生长特性的影响将初始发酵培养基中的生长因子以蛋白胨、酵母粉、牛肉粉按0.5 g/L的含量替代添加，接种量为2%光照厌氧培养96 h测OD660 nm值。选择最佳生长因子并配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L进行进一步试验。1.4Box-benhken优化试验由浓度梯度试验确定响应面试验的中心点及区间，以Design-expert10.0软件设计方案，优化乙酸钠、草酸铵、酵母粉配比。以菌株生长OD660 nm值为响应值进行17组Box-benhken试验设计（见表1）。对试验结果进行分析，得到最佳培养基配比并进行验证[21]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.T001表1Box-benhken试验设计因素与水平水平A草酸铵B乙酸钠C酵母粉-120.51.5031.02.0141.52.5g/L1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS软件进行统计分析，Duncan's方法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1光合细菌富集结果富集的32个样品中3个样品有颜色变化，颜色分别为棕红色、紫红色及深红色。2.2光合细菌的形态学特征（见表2、图1）由表2、图1可知，本试验从北京东升科技园分离纯化得到棕红色的RC3-1菌株，从福建龙海市水样分离纯化得到了紫红色的DBNRh06菌株，从广东佛山水样中分离纯化得到深红色的菌株DBNRh32。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.T002表2光合细菌菌株形态特征菌株编号分离地菌体形态革兰氏染色液体培养菌落形态菌株形态溶血性RC3-1北京短杆状G-棕红色圆形椭球形阴性DBNRh06福建龙海市棒状或短杆状G-紫红色针尖状细杆状阴性DBNRh32广东佛山球状G-深红色圆形圆球形阴性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F001图1菌株形态特征2.316S rRNA鉴定结果对筛得菌株提取基因组DNA进行16S rRNA基因扩增并测序，获得的菌株序列提交至NCBI数据库进行比对申请基因登录号，结合相似度最高的模式菌株序列构建系统发育树（见图2）。由图2可知，RC3-1为荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus），DBNRh06为沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris），DBNRh32为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F002图2基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树2.4亚硝酸盐降解率的标准曲线及测定结果2.4.1标准曲线的制作（见图3）由图3可知，亚硝酸盐含量标准曲线拟合方程为y=0.331 1x+0.071 2，R2=0.999 8，表明模型拟合度高，可作为标准曲线使用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F003图3亚硝酸盐标准曲线2.4.2不同菌株亚硝酸盐降解率（见表3）由表3可知，RC3-1亚硝降解率较差，显著低于其余菌株（P0.05）；DBNRh32与DBNRh06均具有较好的亚硝降解率，在光照及黑暗情况下培养24、48 h均可达到65%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.T003表3不同菌株亚硝酸盐降解率组别24 h光照培养48 h光照培养24 h暗培养48 h暗培养RC3-115.27±5.79c39.36±4.29b2.28±2.28c20.61±2.06bDBNRh3268.65±0.75a68.83±0.76a68.27±1.46a68.49±0.82aDBNRh0635.88±1.43b67.38±0.28a19.62±1.74b65.67±1.07a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%2.5菌株在不同盐度下的生长状况（见图4）由图4可知，盐度为5时，RC3-1、DBNRh32、DBNRh06均生长良好；盐度为15时，RC3-1、DBNRh06仍生长良好，DBNRh32生长状况一般；盐度为25时，DBNRh06仍生长状况良好，RC3-1生长状况一般，DBNRh32生长状况较差；盐度为35时，DBNRh06仍生长状况良好，RC3-1生长状况一般，DBNRh32生长状况极差。结果表明，DBNRh06对盐度具有较好的耐受性，RC3-1次之，DBNRh32对盐的耐受性最差。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F004图4菌株在不同盐度下生长状况2.6菌株DBNRh06在不同温度下的亚硝酸盐降解率（见图5）由图5可知，15~25 ℃条件下，DBNRh06在24 h时降亚硝酸盐的效果均不显著，48 h时25 ℃下DBNRh06亚硝酸盐降解率可达50%以上，但在15、20 ℃下亚硝降解率无大幅度提升；96 h时，DBNRh06在25 ℃下的亚硝酸盐降解率可达60%以上；120 h时，DBNRh06在15、20、25 ℃下的亚硝酸盐降解率均可达50%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F005图5菌株DBNRh06在不同温度下的亚硝酸盐降解率2.7单因素试验结果2.7.1不同种类、浓度碳源对菌株DBNRh06生长特性的影响（见图6、图7）由图6可知，乙酸钠作碳源时，菌株OD660 nm值显著高于其他种类的碳源。因此选取乙酸钠作为碳源进行浓度梯度试验。由图7可知，乙酸钠浓度为0.6~1.0 g/L时，DBNRh06的OD660 nm值随乙酸钠浓度增高而增高；乙酸钠浓度为1.0~5.0 g/L时，DBNRh06的OD660 nm值基本不随乙酸钠增长而变化；乙酸钠浓度为5.0~7.0 g/L时，DBNRh06的OD660 nm值下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F006图6不同碳源对菌株DBNRh06生长特性的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F007图7不同浓度碳源对菌株DBNRh06生长特性的影响2.7.2不同种类、浓度氮源对菌株DBNRh06生长特性的影响（见图8、图9）由图8可知，草酸铵作氮源时，菌株OD660 nm值显著高于其他种类的氮源。因此选取草酸铵作为氮源进行浓度梯度试验。由图9可知，草酸铵浓度为0.1%~0.3%时，菌株DBNRh06的OD660 nm值随草酸铵浓度的增加而增长，在草酸铵浓度为0.3%时达到最大值，随后下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F008图8不同氮源对菌株DBNRh06生长特性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F009图9不同浓度氮源对菌株DBNRh06生长特性的影响2.7.3不同种类、浓度生长因子对菌株DBNRh06生长特性的影响（见图10、图11）由图10可知，酵母粉作生长因子时，菌株OD660 nm值显著高于其他种类的生长因子，选取酵母粉为最佳生长因子进行浓度梯度试验。由图11可知，酵母粉浓度为0.5~1.5 g/L时，菌株DBNRh06的OD660 nm值随酵母粉浓度的增加而快速增加；酵母粉浓度为1.5~3.0 g/L时，菌株DBNRh06的OD660 nm值随酵母粉浓度的增加而缓慢增加，选取酵母粉添加量为3 g/L进行进一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F010图10不同生长因子对菌株DBNRh06生长特性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F011图11不同浓度生长因子对菌株DBNRh06生长特性的影响2.8Box-benhken优化试验结果（见表4、表5、图12）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.T004表4响应面试验结果试验号ABCOD660 nm值1-1-100.54±0.01fg21-100.51±0.01g3-1100.85±0.03a41100.75±0.04d5-10-10.77±0.04bcd610-10.69±0.02e7-1010.79±0.04bcd81010.77±0.05cd90-1-10.50±0.03g1001-10.82±0.03abc110-110.58±0.02f120110.83±0.03ab130000.76±0.07cd140000.80±0.01abcd150000.76±0.02d160000.75±0.05d170000.78±0.02bcd注：不同字母表示差异显著（P0.05）；相同字母表示差异不显著（P0.05）。图12各因素交互作用对DBNRh06生长增殖的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F12a1（a）草酸铵和乙酸钠对OD660 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F12a2（b）草酸铵和酵母粉对OD660 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.F12a3（c）乙酸钠和酵母粉对OD660 nm值的影响以草酸铵3 g/L、乙酸钠1 g/L、酵母粉2 g/L为中心点，以OD660 nm值为响应值进行Box-benhken优化试验，模型二次拟合回归方程：y=0.770 0-0.028 7A+0.142 5B+0.014 0C-0.017 5AB+0.015 0AC-0.017 5BC-0.017 5A²-0.0900B²+0.002 5C²。由表5可知，该模型的一次项B对结果影响极显著（P0.01），该模型R2=0.991 6，模型极显著（P0.01），失拟项不显著（P0.05），拟合模型可用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.020.T005表5Box-Benhken试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型0.207 590.023 190.930.000 1A0.006 610.006 626.080.001 4B0.156 810.156 8618.370.000 1C0.004 510.004 517.800.003 9AB0.001 210.001 24.830.063 9AC0.000 910.000 93.550.101 6BC0.001 210.001 24.830.063 9A²0.001 310.001 35.090.058 8B²0.034 110.034 1134.500.000 1C²0.000 010.000 00.103 80.756 7残差0.001 870.000 3失拟项0.000 230.000 10.145 80.927 2纯误差0.001 640.000 4总差0.209 316注：P0.05表示影响显著。由模型预测得出，草酸铵2 g/L、乙酸钠1.5 g/L、酵母粉1.5 g/L时，DBNRh06的OD660 nm值达到理论最大值0.860，与验证试验取平均值测得的OD660 nm值为0.877接近，表明回归方程能够较真实地反映各因素对DBNRh06生长增殖的影响。3讨论高密度集约工厂化养殖已逐步成为水产养殖的发展趋势，但高密度集约化养殖会致使水质严重污染，导致水生动物疾病频发等问题，因此养殖水体水质问题是制约水产养殖业发展的关键问题之一[22-23]。养殖废水净化分为物理法、化学法及生物法。物理法无法去除溶解于水中的氮、磷等污染物，化学法成本过高。与物理法及化学法相比，生物法具有费用低、净化彻底且不破坏生态平衡等优点[24-25]。已有多位学者对生物法处理养殖废水进行了研究，李茹霞等[1]研究发现，番杏可去除不同盐度海水养殖废水中的亚硝酸盐，但植物对于生长空间等条件的要求导致其应用的局限性。微藻类作为浮游植物具有占地空间小易于培养的优势，如Cardoso等[26]指出，螺旋藻可对水产养殖废水进行植物修复，但藻类的过度生长会消耗大量的二氧化碳，导致水体pH值上升，同时释放大量有机碳，致使水质恶化。细菌具有适应性强、生长速度快等优点，曲寅等[27]筛选出一株能够有效降低水体亚硝酸盐氮含量的肺炎克雷伯菌，但该菌的安全性有待进一步验证。光合细菌不仅安全性高还能够净化水质，有效降低水体中有害物质，可在低氧的水生环境中生长[28]。关于光合细菌的研究已有很多，如：卫燕红等[29]研究了多株光合细菌混养时的最适条件；郑颖等[30]研究光合细菌混合菌群MPB1对养殖废水的净化效果；Zhang等[31]指出水中添加光合细菌可以显著减少亚硝酸盐还原剂和厌氧细菌的数量。但养殖水产品的多样性对光合细菌的作用温度及耐受性提出了进一步的要求。本研究由水环境样中分离菌株，经耐低温耐盐实验进一步筛菌，筛得一株耐盐耐低温且具有优良降亚硝酸盐作用的光合细菌DBNRh06，并对其培养基进行优化，但DBNRh06的发酵条件及在不同养殖品种应用差异可进一步探索。4结论本研究从福建龙海市水样中筛得一株耐盐可在低温下降亚硝酸盐的沼泽红假单胞菌DBNRh06，并采用响应面优化法对DBNRh06培养基优化，得到最优条件为草酸铵2 g/L、乙酸钠1.5 g/L、酵母粉1.5 g/L。利用最优培养基配方，在30 ℃、1 000~2 000 lx光照培养96 h，得到DBNRh06的OD660 nm值为0.877，与预测的最大值0.860非常接近。本研究结果可为光合细菌在水产养殖业的实际应用奠定基础。