中草药饲料添加剂具有功能多样、高效、药物残留低等优点，在畜禽养殖中具有较好的应用前景[1-3]。受提取工艺的限制，中药经提取后依然保留了多糖、黄酮和皂苷等生物活性成分，利用微生物对中药药渣进行发酵可以对中药资源进行“二次开发”[4-6]。谭显东等[7]利用康宁木霉固态发酵中药渣制作蛋白质饲料，与发酵前对比，发酵产物的真蛋白质含量增加60.07%，粗纤维降解率为39.95%。贺晓玉等[8]利用发酵五味子药渣饲喂断奶仔猪，发现仔猪免疫功能增强，腹泻率和料重比降低。在饲料中添加经过发酵处理的中药渣，有助于改善畜禽的生长性能，提高抗病力，调节其肠道菌群[9-11]。双黄连可用于治疗畜禽的感冒发热、呼吸道及肠炎性疾病，但适口性差，在畜禽养殖中应用时受到了很大的限制，直接饲喂药渣的效果并不理想。为了改善双黄连药渣的适口性，本研究利用植物乳杆菌发酵双黄连药渣饲喂断奶仔猪，研究其对断奶仔猪的生长性能、腹泻率、免疫及肠道微生物菌群组成的影响，以期开发新型中草药渣饲料添加剂。1材料与方法1.1试验材料植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-1522由本实验室分离保存。双黄连药渣经低温烘干、粉碎后过60目筛。MRS培养基：牛肉膏10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.28 g/L、吐温80 1.0 g/L，pH值6.2~6.4。1.2双黄连药渣发酵制备试验前期已采用Box-Behnken响应面试验设计优化双黄连药渣的发酵条件[12]。双黄连药渣粉碎过筛，用无菌水调制含水量至64%，115 ℃灭菌30 min，自然冷却至室温，将植物乳杆菌LP-1522培养液（≥108 CFU/L）接种于发酵罐中，控制温度35 ℃，厌氧发酵72 h，发酵结束后取样测定发酵产物的植物乳杆菌数量，将发酵后的双黄连药渣进行低温烘干。1.3发酵双黄连药渣成分检测1.3.1发酵双黄连药渣主要成分检测水分测定方法参照GB/T 6435—2014；粗蛋白测定方法参照GB/T 6432—2018中的凯氏定氮法；粗纤维测定方法参照GB/T 6434—2006；总黄酮测定方法参照文献[13]的方法。1.3.2发酵双黄连药渣饲用安全性检测参考GB 13078—2001对发酵双黄连药渣中总砷、黄曲霉毒素、呕吐毒素、总铬、氰化物、沙门氏杆菌进行测定，评价发酵产物的饲用安全性。1.4试验设计与饲养管理选取21日龄“杜×长×大”三元杂交健康断奶仔猪96头，随机分为4组，每组4个重复，每个重复6头仔猪。A组（对照组）断奶仔猪饲喂基础日粮；B组在基础日粮中添加2%发酵药渣；C组在基础日粮中添加2%未发酵药渣；D组在基础日粮中添加乳酸菌菌剂（108 CFU/L）。预试期7 d，正式试验期28 d。基础日粮参照NRC猪饲养标准配制，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米64.52消化能/(MJ/kg)13.80豆粕26.13粗蛋白/%19.00鱼粉2.69赖氨酸/%1.20乳清粉3.26钙/%0.82石粉0.65磷/%0.66碳酸氢钙1.43盐0.32预混料1.00注：1.预混料为每千克日粮提供：Cu 180 mg、Fe 220 mg、Mn 55 mg、Zn 210 mg、I 0.3 mg、Se 0.3 mg、Co 0.3 mg、VA 15 000 IU、VD3 3 700 IU、VE 50 IU、VK 4.5 mg、VB1 4 mg、VB2 12 mg、VB6 7.5 mg、VB12 35 μg、生物素150 μg、泛酸35 mg、叶酸2.5 mg、烟酰胺50 mg、氯化胆碱550 mg。2.营养水平均为计算值。定期观察统计断奶仔猪腹泻率、死亡率和生长情况。断奶仔猪自由采食和饮水，按猪场常规方法定期进行猪舍的免疫消毒程序。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能试验断奶仔猪分别于0、28 d空腹12 h后进行称重，计算其平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。ADG=(末重-初重)/试验天数(1)ADFI=总采食量/试验天数(2)F/G=平均日采食量/平均日增重(3)腹泻率=腹泻仔猪头次/(试验仔猪头次×试验天数)×100%(4)1.5.2血清生化指标与免疫指标试验结束时从各试验组随机选取健康状况良好、体重相近的仔猪，喂料前进行前腔静脉采血，分离血清。采用全自动生化分析仪测定血清生化指标（总蛋白、总胆固醇、尿素氮、谷草转氨酶、谷丙转氨酶）。采用间接酶联免疫吸附ELISA试剂盒测定血清免疫指标，包括免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.5.3盲肠微生物菌群每组随机选取断奶仔猪5头，于试验0、14、28 d采集仔猪盲肠粪便样品，利用无酶无菌离心管收集，采集后直接贮存在干冰中，送往测序公司进行生物多样性分析。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行前期处理，SPSS 19.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵双黄连药渣乳酸菌数量采用平板计数法对发酵双黄连药渣中乳酸菌的有效活菌数量进行测定，结果显示，发酵双黄连药渣中乳酸菌含量达6.0×108 CFU/g。2.2发酵双黄连药渣成分测定结果（见表2）由表2可知，发酵后双黄连药渣的粗纤维含量下降2.34%，粗蛋白含量提高6.83%，总黄酮含量提高7.03%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.T002表2发酵双黄连药渣的主要成分项目水分/%粗蛋白/%粗纤维/%总黄酮/(mg/100 g)未发酵药渣77.011.2834.231.3发酵药渣78.412.0533.433.52.3发酵双黄连药渣饲用安全性检测结果（见表3）由表3可知，发酵药渣中总砷、总铬、黄曲霉毒素、氰化物、沙门氏杆菌含量均低于《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）规定的限量，发酵药渣可用于断奶仔猪饲喂试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.T003表3发酵双黄连药渣饲用安全性检测结果项目总砷/(mg/kg)总铬/(mg/kg)黄曲霉毒素B1/(μg/kg)氰化物/(mg/kg)沙门氏菌/(CFU/25 g)检测结果0.140.200.3010.00—GB 13078—2017≤2.00≤10.00≤10.00≤50.00—注：“—”表示未检出。2.4发酵双黄连药渣对断奶仔猪生长性能的影响（见表4）由表4可知，B组断奶仔猪的平均日增重和日采食量显著高于D组和对照组（P0.05），料重比和腹泻率显著低于D组和对照组（P0.05）。因此，饲喂发酵双黄连药渣能够显著降低断奶仔猪的腹泻率，提高饲料转化率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.T004表4发酵双黄连药渣对断奶仔猪生长性能的影响组别初重/(kg/头)末重/(kg/头)平均日采食量/[g/(头·d)]平均日增重/[g/(头·d)]料重比腹泻率/%A组（对照组）7.82±0.3616.37±0.71b592.57±25.16b305.45±15.91c1.94±0.03a9.82±0.19aB组7.77±0.2318.07±0.65a661.10±24.62a369.33±16.52a1.79±0.04c4.77±0.16cC组7.89±0.4217.59±0.69ab633.21±25.13ab349.84±15.43ab1.81±0.02bc4.54±0.11cD组7.68±0.2816.72±0.76ab600.67±26.78b322.94±16.24bc1.86±0.03b6.42±0.13b注：同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.5发酵双黄连药渣对断奶仔猪血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，B组仔猪血清总蛋白含量比对照组提高了7.34%（P0.05），；血清尿素氮含量较对照组显著降低（P0.05）。各组断奶仔猪血清中总胆固醇含量、谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.T005表5发酵双黄连药渣对断奶仔猪血清生化指标的影响组别总蛋白/(g/L)总胆固醇/(mmol/L)尿素氮/(mmol/L)谷草转氨酶/(U/L)谷丙转氨酶/(U/L)A组（对照组）50.24±1.86b2.38±0.194.43±0.18a51.16±5.6460.94±5.71B组54.22±1.71a2.25±0.164.06±0.14b45.25±5.1154.83±6.04C组53.51±1.64ab2.31±0.184.13±0.15ab47.44±5.3256.25±6.46D组51.98±1.78ab2.24±0.164.25±0.15ab50.12±5.8557.63±6.922.6发酵双黄连药渣对断奶仔猪血清免疫指标的影响（见表6）由表6可知，B组断奶仔猪血清IgG和IgA含量显著高于对照组和D组（P0.05），各组断奶仔猪血清IgM含量无显著差异（P0.05）。发酵双黄连药渣有助于改善断奶仔猪的血清免疫水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.T006表6发酵双黄连药渣对仔猪免疫功能的影响组别IgGIgAIgMA组（对照组）3.26±0.28b0.52±0.10b0.29±0.02B组4.02±0.25a0.74±0.11a0.34±0.03C组4.05±0.23a0.70±0.10a0.35±0.04D组3.47±0.21b0.59±0.12b0.31±0.03g/L2.7发酵双黄连药渣对断奶仔猪肠道菌群的影响（见图1~图3）由图1可知，饲喂0 d基于门水平的断奶仔猪肠道菌群主要为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋菌门（Spirochaetes）及柔膜菌门（Tenericutes），断奶初期仔猪肠道中的优势菌为厚壁菌门和拟杆菌门，试验初期各组间断奶仔猪肠道菌群组成无明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.F001图1基于门水平的仔猪肠道菌群组成（0 d）由图2可知，饲喂第14 d，属水平的断奶仔猪肠道菌群主要由乳酸杆菌（Lactobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、普雷沃氏菌（Prevotella）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、梭菌（Clostridium）等组成。其中，乳酸杆菌属成为断奶仔猪肠道的优势菌。B组、C组和D组断奶仔猪肠道内乳酸杆菌的相对丰度明显高于对照组，D组断奶仔猪肠道中乳酸杆菌相对丰度最高，但其大肠埃希氏菌-志贺菌（Escherichia-Shigella）相对丰度明显高于药渣试验组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.F002图2基于属水平的仔猪肠道菌群组成（14 d）由图3可知，饲喂第28 d，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）成为断奶仔猪肠道的优势菌属，B组、C组和D组断奶仔猪肠道内普雷沃氏菌属（Prevotella）和拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度明显高于对照组，对照组断奶仔猪肠道中乳酸杆菌属（Lactobacillus）含量明显低于其他试验组。对照组和D组断奶仔猪肠道中链球菌属（Streptococcus）明显高于B组和C组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.005.F003图3基于属水平的仔猪肠道菌群组成（28 d）3讨论3.1发酵双黄连药渣对断奶仔猪生长性能的影响利用微生物发酵中药废弃物能够提高中药渣的消化性，降低毒副性，改善适口性[14-15]。李华伟等[16]在猪饲粮中分别添加中药渣和发酵中药渣制剂，发现发酵中药渣制剂具有更好的促生长效果。聂铭等[17]研究发现，在肉鸡基础日粮中添加中药渣发酵液可以改善肉鸡的生长性能，调节肠道微生态平衡。本研究中，采用实验室前期自主分离的、产酸性能优异的植物乳杆菌LP-1522（Lactobacillus plantarum）作为发酵菌株，利用其发酵双黄连药渣，发酵药渣兼具中草药和益生菌的双重功效，具有酸香味道，有助于促进仔猪采食。饲喂结果显示，发酵双黄连药渣组断奶仔猪的平均日采食量比未发酵药渣组提高4.22%，比乳酸菌剂组高了9.14%，表明双黄连药渣经植物乳杆菌发酵后更利于仔猪采食。发酵双黄连药渣组断奶仔猪的日增重比未发酵药渣组提高5.28%，比乳酸菌剂组提高12.56%，表明发酵双黄连药渣在提高仔猪日增重方面具有显著作用。饲喂发酵药渣后断奶仔猪的料重比显著降低，饲料转化率升高。3.2发酵双黄连药渣对断奶仔猪血清生化指标与免疫指标的影响检测断奶仔猪的血清生化指标有助于监测健康状况。血清总蛋白含量能够反映断奶仔猪的蛋白质代谢能力，与断奶仔猪的营养状况具有一定的相关性。血清尿素氮含量可用于监测仔猪的氨基酸代谢情况。血清总胆固醇含量能够反映仔猪的脂质吸收与利用情况。武洪志等[18]研究表明，日粮中添加发酵复方中草药能够提高断奶仔猪的血清总蛋白含量，降低血清总胆固醇含量。本研究中，试验28 d，与对照组相比，发酵药渣组断奶仔猪血清总蛋白含量显著升高7.34%，尿素氮含量显著降低8.35%，总胆固醇水平无显著变化，表明发酵双黄连药渣对提高仔猪的蛋白质代谢水平具有显著作用。谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性是反映肝脏和心脏受损程度的重要指标。本研究中，各试验组仔猪血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性无显著变化，表明发酵双黄连药渣对仔猪肝脏和心脏无显著损害。仔猪血清免疫指标的检测有助于反映其机体免疫力。IgG参与断奶仔猪的体液免疫反应，在仔猪血清中含量最高，能够反映仔猪的免疫状况。IgA和IgM分别在抗菌、抗病毒以及仔猪肠道免疫中发挥重要作用。本研究中，试验28 d发酵药渣组和药渣组断奶仔猪血清IgG和IgA含量均显著高于对照组与乳酸菌剂组，表明发酵双黄连药渣对提高仔猪免疫水平具有重要作用。3.3发酵双黄连药渣对仔猪肠道微生物菌群的影响仔猪肠道微生物菌群的平衡是影响其肠道健康的重要因素，仔猪断奶后其肠道菌群会发生显著变化，有害菌的大量定殖会导致仔猪严重腹泻，甚至死亡。肠道微生物菌群在提供肠道保护屏障、代谢营养物质、调节肠道黏膜免疫等方面发挥重要作用[18-20]。调控肠道微生物菌群已经成为疾病防治的替代性策略[21]。本研究中，仔猪肠道的优势菌群随着饲喂时期的不同发生变化。饲喂初期，发酵药渣组仔猪肠道主要优势菌为厚壁菌门和拟杆菌门，包括拟杆菌科（Bacteroidaceae）肠球菌科（Enterococcaceae）及梭菌科（Clostridiaceae）等。饲喂14 d，仔猪肠道主要由乳酸杆菌（Lactobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、普雷沃氏菌（Prevotella）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、梭菌等菌属（Clostridium）组成，乳酸杆菌（Lactobacillus）成为其肠道优势菌。饲喂28 d，普雷沃氏菌属（Prevotella）和拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度明显提高，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）成为仔猪肠道的优势菌。拟杆菌（Bacteroides）、普雷沃氏菌（Prevotella）、瘤胃球菌（Ruminococcus）均为纤维降解菌，可将饲料残渣降解为短链脂肪酸，为肠上皮细胞供能[22]。以上结果表明，饲喂乳酸菌发酵的双黄连药渣可以提高断奶仔猪肠道内有益菌的相对丰度。此外，饲喂发酵双黄连药渣后，断奶仔猪的腹泻率显著降低，仔猪肠道中乳酸杆菌的相对丰度明显升高，大肠埃希氏菌-志贺菌（Escherichia-Shigella）、链球菌（Streptococcus）等致病性细菌的丰度明显降低，饲喂发酵双黄连药渣有助于抑制仔猪肠道致病性细菌，调节肠道微生物菌群平衡。益生菌也有助于改善仔猪的肠道健康。本研究中，植物乳杆菌组断奶仔猪肠道的乳杆菌属相对丰度很高，但其致病性微生物的相对丰度也随之升高，单一使用益生菌对仔猪肠道病原菌的抑制作用不如发酵双黄连药渣组显著。4结论本试验中，发酵双黄连药渣在提高仔猪的生长性能、抑制肠道病原菌、降低仔猪腹泻率、提高机体免疫性能方面具有重要作用，有助于提高仔猪的健康水平。发酵双黄连药渣作为饲料添加剂具有较好的应用前景。