断奶应激是仔猪早期断奶产生的一系列综合征，可激活相关炎症通路引起肠道炎症反应，导致肠道菌群及代谢物组成发生改变，从而诱导仔猪发生腹泻[1]。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，可激活TLR4通路引起炎症反应，导致肠道屏障损伤及功能障碍[2]。芳香烃受体（AhR）是一种由配体激活的转录因子，在调节肠道菌群、减轻肠道炎症以维持肠道功能中发挥重要作用[3-4]。6-甲酰基吲哚并[3, 2-B]咔唑（6-Formylindolo[3, 2-b]carbazole，FICZ）作为AhR的内源性配体，可通过激活AhR有效的调节肠道菌群失调，抑制肠道炎症以及保护肠道屏障[5-6]。研究表明，FICZ可通过激活AhR显著改善小鼠抗生素诱导的肠道菌群耗竭，恢复至与粪菌移植相似的肠道菌群水平[7]。豆蔻明（cardamonin，CDN）是一种黄酮类查耳酮化合物的植物提取物[8]，具有抑菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等生物学活性[9-12]。研究发现，CDN作为AhR外源性配体在缓解肠道炎症方面发挥重要调节作用[13-14]。此外，CDN对有害菌如幽门螺旋杆菌具有较强的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等菌株也具有一定的抑菌活性[15]。但目前尚未见关于AhR活化通过调控肠道菌群保护断奶仔猪肠道健康的相关报道。本研究通过LPS建立仔猪免疫应激模型，研究AhR活化对免疫应激仔猪肠道菌群和短链脂肪酸的影响，为断奶仔猪肠道菌群的营养调控及豆蔻明作为饲料添加剂的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料CDN购自南京景竹生物科技有限公司，纯度≥98％，FICZ购自上海易恩化学技术有限公司，纯度≥98％，LPS购自Sigma公司，纯度≥99％。1.2试验设计及饲养管理试验选取断奶仔猪24头，随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。对照组（CON）为基础日粮，LPS应激组（LPS）仔猪屠宰前腹腔注射100 μg/kg BW LPS，FICZ组（FICZ）仔猪腹腔注射250 μg/kg FICZ+屠宰前注射LPS，CDN组（CDN）仔猪腹腔注射6 mg/kg CDN+屠宰前注射LPS。仔猪自由采食、饮水，正式试验期15 d。从试验第8 d开始，FICZ、CDN组仔猪每天腹腔注射FICZ或CDN（均用无菌生理盐水和少量的DMSO配制），其余两组注射等量无菌生理盐水。试验第15 d，除CON组外，其余试验组仔猪腹腔注射LPS（100 μg/kg BW），CON组仔猪注射等量生理盐水。注射6 h后所有仔猪屠宰，采集结肠内容物样品-80 ℃保存，用于分析微生物群组成及测定短链脂肪酸含量。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米55.70消化能/(MJ/kg)14.57豆粕18.80粗蛋白质/%20.22膨化大豆8.50钙/%0.79鱼粉5.50总磷/%0.66乳清粉4.50赖氨酸/%1.52豆油1.90蛋氨酸/%0.50蔗糖1.88苏氨酸/%0.86磷酸氢钙0.70色氨酸/%0.29石粉0.60L-赖氨酸0.33DL-蛋氨酸0.14L-苏氨酸0.05L-色氨酸0.05食盐0.35预混料1.00注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 9 000 IU、VD3 1 200 IU、VE 65 IU、VK3 2.5 mg、VB1 2.5 mg、VB2 6.0 mg、VB12 0.03 mg、叶酸1.5 mg、烟酸25 mg、泛酸 22 mg、生物素0.2 mg、铜80 mg、铁120 mg、锰45 mg、锌120 mg、硒0.3 mg、碘0.3 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.3测定指标及方法1.3.1肠道菌群多样性分析肠道样品送至北京奥维森基因科技有限公司，使用高通量测序技术对结肠内容物进行16S rRNA基因测序。1.3.2短链脂肪酸含量结肠内容物短链脂肪酸含量采用气相色谱仪（安捷伦7890B Agilent）测定。称量2 g结肠内容物，加入含有2 mL预冷ddH2O中，振荡混匀。4 ℃、15 000 r/min离心10 min，取上清液1.5 mL加入0.3 mL 25%偏磷酸溶液混匀，冰浴30 min，再次4 ℃、15 000 r/min离心10 min取上清液，经0.22 μm滤膜过滤于进样瓶中。色谱条件：色谱柱（HP-INNOWAX，30 m × 250 μm × 0.25 μm），载气为氮气，总流量为25 mL/min，进样口为分流模式，分流比10∶1，加热器温度220 ℃，样品进样量1 μL。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 21进行单因素方差分析，Duncan's法组间多重比较。肠道菌群多样性分析分别采用图基检验、偏最小二乘法判别分析、组间显著性差异分析（metastats）分析各组间α多样性指数和β多样性以及门（属）水平上的组间差异，LDA effect size（LEfSe）分析获得显著差异且影响力大的差异菌属。P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1AhR活化对免疫应激仔猪结肠菌群多样性的影响2.1.1结肠菌群OTU聚类和结肠菌群α多样性结果（见图1）图1结肠菌群OTUs及α多样性分析注：“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F1a1（a）Venn图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F1a2（b）α多样性指数箱式图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F1a3（c）Shannon-Wiener曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F1a4（d）Specaccum物种累积曲线由图1（a）可知，有效序列经过uparse聚类（97%的相似水平下）、抽平等方式产生共5 244个操作单元（OTU）。4组仔猪结肠内容物菌群共有的OTU数目为1 360个，CON组、LPS组、FICZ组及CDN组特有的OTU数分别为615、283、460、583个。由图1（b）可知，与CON组相比，LPS组的α多样性指数无显著变化（P0.05）。与LPS组相比，FICZ组的Chao1、PD_whole_tree指数呈升高趋势（P0.05）；CDN组Chao1指数极显著升高（P0.01）、Observed_species指数显著升高（P0.05）。由图1（c）可知，Shannon-Wiener曲线可反映各样本在不同测序深度时的微生物多样性，图中曲线趋向平坦，表明测序数据量足够大，可反映样本中绝大多数的微生物信息。由图1（d）可知，Specaccum物种累积曲线可在反映样本量是否充分的基础上对物种丰富度进行预测；在一定范围内，随着样本量加大，曲线表现趋于平缓，表示此环境中的物种并不会随样本量的增加而显著增多。2.1.2仔猪结肠菌群β多样性分析（见图2）β多样性反映不同测序样本之间的微生物物种多样性情况。本研究基于OTU的偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。由图2可知，4组间的仔猪结肠菌群结构差异明显。FICZ组与LPS组的OTU聚类较远，CDN组与LPS组的OTU聚类也较远，表明FICZ组、CDN组与LPS组间的仔猪结肠菌群结构存在明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F002图2仔猪结肠菌群β多样性分析2.1.3仔猪结肠菌群组成及相对丰度分析（见图3）图3（a）、图3（b）分别为相对丰度排名前20的优势菌门、菌属。由图3（a）可知，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）为仔猪结肠相对丰度最高的3个优势菌门，其中Firmicutes占比最多，Bacteroidetes和Proteobacteria次之。与LPS组相比，FICZ组仔猪结肠WPS-2、Synergistota、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、螺旋体门（Spirochaetota）、蓝藻门（Cyanobacteria）相对丰度明显增加，Firmicutes的相对丰度明显降低；CDN组仔猪结肠放线菌门（Actinobacteriota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、Synergistota、Verrucomicrobiota、Cyanobacteria的相对丰度明显增加，Firmicutes和Patescibacteria的相对丰度明显降低。由图3（b）可知，与LPS组相比，FICZ组仔猪结肠的Clostridium_sensu_stricto_1明显降低，而CDN组的普氏菌属相对丰度明显减少。由图3（c）metastats分析结果可知，与LPS组相比，FICZ组和CDN组仔猪结肠Anaerotruncus、梭状芽孢杆菌属（Cloacibacillus）、阿利斯佩斯菌属（Alistipes）、盐单胞菌属（Halomonas）、气微菌属（Aeromicrobium）、Sediminispirochaeta、帕拉普菌属（Paraprevotella）、粪球菌属（Faecalicoccus）、副萨特菌属（Parasutterella）、Intestinimonas、互养菌属（Synergistes）、柯林斯氏菌属（Collinsella）、Barnesiella和Odoribacter的相对丰度均明显提高，Moryella相对丰度明显降低。图3仔猪结肠菌群组成及相对丰度分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F3a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F3a2（b）属水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F3a3（c）基于metastats的差异菌属2.1.4AhR活化对免疫应激仔猪结肠菌群的LDA分布的影响仔猪结肠菌群的LDA分布见图4。由图4可知，基于LEfSe分析选择LDA值大于3的存在差异的物种，用于分析不同组差异显著的菌属。在属水平上，FICZ组仔猪结肠中的普氏菌属（Prevotella）、解琥珀酸菌属（Succiniclasticum）、光岗菌属（Mitsuokella）、优杆菌属（Eubacterium_eligens_group）和甲烷球菌属（Methanosphaera）明显富集。CDN组仔猪结肠柯林斯氏菌（Collinsella）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、丁酸弧菌属（Butyricimonas）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、巨单胞菌属（Megamonas）、梭杆菌属（Fusobacterium）、克里斯滕森菌科R7群（Christensenellaceae_R_7_group）、UCG_002属、拟杆菌属（Bactericides）和琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）明显富集。图4仔猪结肠菌群的LDA分布10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F4a1（a）LDA分布柱状图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F4a2（b）LDA分布进化分支图2.2AhR活化对免疫应激仔猪结肠肠道菌群功能丰度的影响（见图5）由图5中功能预测可知，与LPS组相比，FICZ组和CDN组断奶仔猪肠道的阿特拉津降解、双酚降解和肾素-血管紧张素系统的功能丰度均得到了显著提升（P0.05）。图5AhR活化对免疫应激仔猪结肠菌群功能丰度的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.F5a1（a）FICZ组和LPS组 （b） CDN组和LPS组2.3AhR活化对免疫应激仔猪结肠短链脂肪酸含量的影响（见表2）由表2可知，与CON组相比，LPS组仔猪结肠短链脂肪酸含量均无显著变化（P0.05）。与LPS组相比，FICZ组仔猪结肠中丙酸、丁酸和戊酸的含量均显著增加（P0.05），CDN组仔猪结肠中戊酸含量显著增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.004.T002表2AhR活化对免疫应激仔猪结肠短链脂肪酸含量的影响组别乙酸丙酸异丁酸丁酸异戊酸戊酸CON组10.40±0.094.56±0.07b0.39±0.012.64±0.002b0.75±0.010.52±0.01bcLPS组8.68±0.303.99±0.10b0.37±0.012.55±0.04b0.68±0.020.36±0.03cFICZ组10.26±0.326.74±0.32a0.44±0.044.41±0.26a0.90±0.081.37±0.12aCDN组7.99±0.134.99±0.14b0.50±0.032.58±0.11b0.98±0.030.77±0.04b注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。mg/g3讨论3.1AhR活化对免疫应激仔猪结肠菌群多样性的影响α多样性可反映微生物群落的丰度和多样性。本试验中，LPS处理对仔猪结肠α多样性无显著影响，但导致总OTU和特有OTU减少，与Dang等[16]的研究结果一致。但Zheng[17]发现，LPS处理导致仔猪肠道菌群α多样性降低（如Shannon指数、Simpson指数降低），与本试验结果不同，可能说明不同仔猪个体肠道菌群对LPS的反应具有一定差异性。本试验发现，CDN处理导致仔猪结肠中Chao1指数和Observed species指数显著升高；FICZ处理可使Chao1指数和PD whole tree指数呈提升趋势。因此，AhR活化能够在一定程度上改善免疫应激仔猪的肠道菌群多样性。3.2AhR活化对免疫应激仔猪结肠菌群组成及丰度的影响本试验metastats分析结果显示，与LPS组相比，FICZ、CDN处理可显著上调仔猪结肠中一些潜在的有益菌属的相对丰度，如Anaerotruncus、Alistipes、Cloacibacillus、Aeromicrobium、Sediminispirochaeta、Paraprevotella、Faecalicoccus、Parasutterella、Collinsella和Odoribacter。其中Anaerotruncus和Intestinimonas能够产生短链脂肪酸[18-19]。Faecalicoccus属于丹毒科，丹毒科是主要的丁酸盐生产菌[20]。黏蛋白降解细菌Alistipes和Cloacibacillus porcorum在调节肠道环境中发挥作用[21-22]。Aeromicrobium是有益共生菌[23]。Sediminispirochaeta和Paraprevotella可产生乙酸盐[24-25]。研究表明，Collinsella产生的熊去氧胆酸盐可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子的表达，并具有抗氧化和抗凋亡活性[26]。此外，Collinsella还具有产生丁酸的能力[27]。Odoribacter与腹泻指数呈负相关[28]。因此，AhR活化可能通过调控肠道菌群进而对肠道健康产生有益作用。LEfSe分析结果显示，FICZ组仔猪肠道中Prevotella、Succiniclasticum、Mitsuokella、Eubacterium_eligens_group、Methanosphaera等菌属明显富集。其中，Prevotella产生乙酸盐作为肠道厌氧微生物发酵的底物，动物肠道中含有较多Prevotella可能对腹泻有更好的缓解作用[29]。Mitsuokella和血清游离氨基酸（FAAs）含量呈显著正相关[30]。此外，Mitsuokella jalaludinii固定相培养上清液具有显著抑制鼠伤寒沙门氏菌生长的能力，并能够产生乳酸、琥珀酸和乙酸[31]。因此，FICZ可能通过促进产生短链脂肪酸的菌属的富集，进而对肠道健康产生有益作用。本试验中，CDN组结肠Butyricimonas、Megamonas、Bacteroides、Fusobacterium、Christensenellaceae_R_7_group、Succinivibrio等有益菌菌属显著富集。Butyricimonas与短链脂肪酸的产生相关[32]。Megamonas可利用各种碳水化合物产生乙酸、丙酸和乳酸[33]。Bacteroides、Fusobacterium与猪生长相关的表型呈正相关[34]。研究表明，Christensenellaceae_R_7_group与剩余采食量（RFI）呈负相关[35]。Succinivibrio与藏猪的纤维素和半纤维素的表观消化率呈正相关[36]。因此，CDN能够调节仔猪肠道菌群组成，改善LPS诱导的肠道微生物屏障紊乱，AhR活化可能通过调控肠道菌群进而对仔猪肠道健康产生有益作用。3.3AhR活化对免疫应激仔猪结肠肠道菌群功能丰度的影响AhR活化对肠道屏障具有一定积极作用。在本研究中，与LPS组相比，FICZ组和CDN组仔猪结肠双酚降解和肾素-血管紧张素系统的功能丰度均得到显著提升。研究表明，双酚A加剧大鼠肠道黏膜炎症和肠道感染易感性，双酚降解有利于缓解炎症反应[37]。肾素-血管紧张素系统（RAS）是一个酶和肽网络，可通过调控炎症反应、刺激血管收缩或松弛以及醛固酮分泌等方面维持机体稳态。在RAS途径中，血管紧张素转换酶2（ACE2）可通过直接或间接的方式减少血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的形成，从而达到抑制Ang Ⅱ引起的血压升高和促炎作用[38]。3.4AhR活化对免疫应激仔猪结肠短链脂肪酸含量的影响短链脂肪酸（SCFAs）的水平在很大程度上受到共生肠道菌群的影响，菌群生态失调可导致产生的SCFAs比例失调[39]。SCFAs是肠道代谢、增殖和分化的调节剂。SCFAs还可通过发挥抗炎作用促进肠道稳态[40]。研究发现，SCFAs与FICZ协同促进AhR的活化[41]。其中，丁酸盐是肠上皮细胞的主要能量来源[40]。丁酸钠能够改善高脂肪饮食诱导的小鼠肠道菌群失调，显著提高有益菌克里斯滕森菌科、布劳特氏菌属和乳杆菌属的相对丰度[42]。戊酸可在正常生理浓度下增强肠道屏障功能[43]。本试验中，FICZ处理可显著提高仔猪结肠丙酸、丁酸和戊酸的含量，与Modoux等[41]研究结果相同。本试验中，CDN处理后仔猪结肠中戊酸的含量显著提高，而其他短链脂肪酸含量无显著变化，可能是由于该组仔猪肠道内产生SCFAs的菌群（如Butyricimonas、Megamonas）和利用SCFAs的菌群（Desulfovibrio）均显著富集且共同作用的结果。AhR活化对免疫应激仔猪结肠短链脂肪酸含量的影响还需要进一步研究。4结论本研究结果表明，AhR活化可调控仔猪结肠肠道菌群组成及短链脂肪酸的合成，缓解LPS诱导的肠道微生物屏障损伤。