随着畜牧业的发展，青贮饲料的需求量增加。青贮玉米饲料的生产周期短、成本低、经济效益高，是畜牧业重要的饲料资源[1]。青贮玉米饲料富含干物质、粗脂肪、纤维素等营养成分，可以提高草食性家畜适口性，提高生产性能[2-3]；能够缓解玉米秸秆焚烧造成的资源浪费和环境污染问题，符合国家“绿色发展”的科学理念[4-5]。根际微生物群落结构能够反映土壤的肥力和植物健康状况，是对植物生长环境综合因素的响应[6]。近年来，根际微生物群落研究已在多种作物中广泛开展[7-8]。根际中的某些微生物不仅能够正向调节作物的生物产量而且可以增强作物的抗病性，被称作有益微生物[9]。荧光假单胞杆菌作为生防菌，具有防治病害和很好的促根生长效果[10]。由荧光假单胞杆菌制成的环保型微生物菌剂，能够促进种子萌发，提高发芽率、出苗率以及植物的生物产量和营养品质[11-13]。本研究使用荧光假单胞杆菌微生物制剂进行青贮玉米播种前拌种处理，采用微生物组分析根际微生物群落结构，近红外技术验证微生物菌剂对青贮玉米营养品质与产量的正向调控作用，为推广应用高产、优质青贮玉米种植方法和栽培方式提供参考。1材料与方法1.1试验材料微生物菌剂：采用一株紫外诱变型荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）F1[14]（菌株保藏号：CGMCC NO.8820）经提纯发酵工艺加工的生防类微生物菌剂，有效活菌数不小于5亿/mL。青贮玉米品种为东单1331，由辽宁东亚种业有限公司提供。1.2试验设计大田试验发现，玉米播种密度为4 400~4 600粒/667 m2，根据种子大小不同，播种密度为2.0~2.5 kg/667 m2，按照2.0 kg/667 m2计算，需要微生物菌剂150 mL/667 m2。菌液直接被喷洒于种子表面，搅拌均匀，阴干后播种，根据作物种子大小、用种量、种皮厚度等情况，酌情增减用量。试验组青贮玉米东单1331拌种所用菌剂浓度为75 mL/kg，播种前对荧光假单胞杆菌菌剂进行拌种，分别于苗期、拔节期与成熟期采集根际土壤，进行16S高通量测序分析，不同处理不同生长时期玉米根际土壤样本编号见表1。对照组（CK）未进行微生物菌剂拌种。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.T001表1不同处理不同生长时期玉米根际土壤样本编号组别苗期拔节期成熟期试验组dongdan1331_A1.1dongdan1331_B1.1dongdan1331_C1.1dongdan1331_A1.2dongdan1331_B1.2dongdan1331_C1.2dongdan1331_A1.3dongdan1331_B1.3dongdan1331_C1.3对照组dongdan1331_A2.1dongdan1331_B2.1dongdan1331_C2.1dongdan1331_A2.2dongdan1331_B2.2dongdan1331_C2.2dongdan1331_A2.3dongdan1331_B2.3dongdan1331_C2.31.3样品采集根际土壤分别采集于生长周期中的苗期、拔节期和成熟期，利用“抖根法”收集玉米根际土壤[15]。收集的土壤样品先过筛（2 mm），去除石头、植物残体和杂物，放入-80 ℃超低温冰箱保存，每组共获得18个根际土壤样本。在乳熟后期，留茬15 cm收割全株青贮玉米。各取样品100 g，旋风磨粉碎，过1 mm筛。1.4测定指标及方法1.4.1生物性质及营养成分手工测量青贮玉米的株高、茎粗、穗高、叶片数、黄叶片数、单棵重、总重和每平方米重，每个生物性状进行3次生物学重复，取平均值。利用FOSS5000近红外分析仪与NIRS技术测定青贮玉米的营养成分。1.4.2样本DNA提取、PCR扩增及Illumina Miseq测序提取土壤总DNA后，以细菌16S rRNA基因的正向338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGCAG-3'）和反向806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）为引物，进行PCR扩增，溶于洗脱缓冲液（Elution Buffer），完成建库。进行Cluster制备和Paired-end测序并进行相应的生物信息学分析[16]。1.5数据统计与分析取Illumina平台下机数据中的有效序列进行后续分析[17]；Flash（V1.2.11）软件组装成一条序列[18]；利用Usearch（V9.1）软件在97%的相似度下进行聚类，RDP classifer（V2.2）软件将OTU代表序列与Greengene数据库进行比对并进行物种注释[19-21]和复杂度/差异性分析。2结果与分析2.1不同处理的青贮玉米生物学性状测量结果（见表2）由表2可知，与对照组相比，试验组青贮玉米株高、茎粗、穗高值、单棵鲜重、6 m2总重及每平方米重明显高于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.T002表2青贮玉米样品生物性状测量结果组别株高/m茎粗/cm穗高/m叶片数/个黄叶片数/个鲜重/(kg/棵)总重/[kg/(4行·2.5 m)]每平方米重/kg试验组2.612.601.051521.1538.396.73对照组2.602.400.891421.1136.206.03研究表明，荧光假单胞杆菌拌种处理明显提高了青贮玉米的生物产量。2.2不同处理的青贮玉米营养成分测定结果（见表3、表4）由表3、表4可知，试验组青贮玉米乳熟后期的粗蛋白含量高达8.80%DM，碳水化合物含量高达18.3%DM。与对照组相比，试验组玉米乳熟后期粗蛋白、碳水化合物、灰分、钙、钾、镁等营养物质含量明显提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.T003表3不同处理青贮玉米的营养成分测定结果组别水分/%干物质/%粗蛋白/%DM碳水化合物/%DM粗脂肪/%DM淀粉/%DM木质素/%DM试验组71.328.78.8018.32.5622.73.15对照组70.529.58.3514.12.8826.53.3210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.T004表4不同处理青贮玉米的矿物质成分分析结果（干物质基础）组别灰分钙磷钾镁试验组5.390.230.231.290.15对照组5.120.200.221.240.13%2.3不同处理对青贮玉米土壤细菌多样性的影响不同处理、不同时期青贮玉米根际土壤微生物群落结构OTUs分析见图1。由图1可知，18个样本中共同含有的OTUs为1 774个；其中A1独有104个OTUs，A2独有82个OTUs，B1独有95个OTUs，B2独有199个OTUs，C1独有207个OTUs，C2独有168个OTUs。经过微生物拌种处理的青贮玉米，苗期（A1）与成熟期（C1）的根际土壤中的OTUs数量明显高于对照组，而拔节期根际土中的OTUs数量（B1）明显小于对照组（B2）。推测原因是玉米拔节期，茎的节间向上迅速伸长，玉米长势迅速，需要大量的水分和养分，玉米根际微生物之间会形成竞争关系，在这种竞争条件下，植物生长速度远高于微生物增长速度；并且生物菌拌种处理使土壤中有益微生物增加，与不利于玉米生长的有害微生物产生拮抗，也可能导致OTUs数减少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.F001图1不同处理、不同时期青贮玉米根际土壤微生物群落结构OTUs分析2.4不同处理青贮玉米样品间的Alpha多样性分析（见表5、图2）由表5、图2可知，Shannon指数曲线平缓说明测序样本量足够；B2组Shannon指数最高说明拔节期根际土壤微生物复杂程度高；C1组的Shannon指数最低、Simpson指数最高，表明青贮玉米拌种试验组的成熟期物种奇异度高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.T005表5不同处理青贮玉米根际土壤微生物多样性指数分析样本编号Sobs指数Chao指数Shannon指数Simpson指数A12 508.0±227.13 438.0±224.06.036±0.1020.013±0.003B12 878.3±87.73 913.7±38.66.367±0.0490.008±0.001C12 263.7±631.42 958.6±664.75.966±0.6210.014±0.010A22 482.3±509.23 480.6±604.06.087±0.4040.009±0.002B23 090.7±21.63 936.8±92.76.589±0.0610.006±0.001C22 735.3±256.53 633.8±202.36.318±0.3560.008±0.00410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.F002图2不同处理、不同时期青贮玉米的细菌群落测序的稀释曲线2.5不同处理青贮玉米根际微生物群落结构差异性分析（见图3）18个土壤样本共得到706 878条序列，6 751个OTUs，注释到24门、57纲、75目、160科、389属、465种。试验选取丰度Top5的物种，展示每组的平均相对丰度以及差异检验的显著性。由图3可知，不同处理组的青贮玉米菌群结构有明显差异，试验组鞘氨醇菌属（Sphingomonas）的相对丰度明显高于对照组。同种处理样本的不同生长时期的菌群结构明显不同，鞘氨醇菌属（Sphingomonas）在对照组与处理组的苗期相对丰度最高，而在各处理组的成熟期相对丰度显著下降，其他优势菌属如芽单胞菌属（Gemmatimonas）、链霉菌属（Streptomyces）等菌属在不同处理组的丰度也有所不同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.F003图3不同处理青贮玉米根际微生物关键物种差异比较注“*”表示差异显著（P0.05）。2.6各处理组青贮玉米根际微生物群落分布情况（见图4、图5）由图4可知，变形菌门在不同处理组中的占比分别为42.69%（A1）、40.33%（A2）、39.61%（B1）、36.78%（B2）、47.28%（C1）、41.15%（C2），说明变形菌门在青贮玉米生长周期的成熟期占比最高，且试验组所占比例均高于对照组；放线菌门在不同处理组中的占比分别为23.15%（A1）、29.84%（A2）、13.71%（B1）、12.17%（B2）、8.74%（C1）、11.22%（C2），说明放线菌门在玉米生长周期的苗期占比最高，微生物菌剂拌种降低了玉米苗期土壤根际土中放线菌门的含量，同样的现象也发生在玉米生长时期的拔节期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.F004图4门分类水平不同处理条件下细菌群落的相对丰度由图5可知，在不同处理组A1、A2、B1、B2、C1、C2中，鞘氨醇菌属（Sphingomonas）是绝对优势菌属，在不同处理组中的占比分别为10.99%（A1）、8.37%（A2）、9.04%（B1）、7.73%（B2）、6.45%（C1）、5.46%（C2），试验组中的占比均高于对照组；其次为小双孢菌属（Microbispora），在不同处理组中的占比分别为5.02%（A1）、3.48%（A2）、0.52%（B1）、0.54%（B2）、0.01%（C1）、0.13%（C2）；排名第三的优势菌属为芽单胞菌属（Gemmatimonas），在不同处理组中的占比分别为4.69%（A1）、2.16%（A2）、6.03%（B1）、6.97%（B2）、6.93%（C1）、5.71%（C2）。鞘氨醇菌属（Sphingomonas）是青贮玉米苗期根际土壤中的绝对优势菌属，且其在试验组A1中的含量高于对照组中的含量；芽单胞菌属（Gemmatimonas）是青贮玉米拔节期的绝对优势菌属，拌种处理降低了芽单胞菌属在青贮玉米拔节期根际土壤中的含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.025.F005图5属分类水平不同处理条件下细菌群落的相对丰度3讨论青贮玉米饲料含有粗脂肪、粗蛋白等营养物质，是反刍动物日粮中的重要组成部分[22]。一般情况下淀粉含量大于28%、粗蛋白含量大于7%、酸性洗涤纤维含量小于22%、中性洗涤纤维含量小于45%为优质青贮玉米[23-24]。纤维素含量是评价青贮饲料质量的一个重要指标，Tjardes等[25]研究表明，反刍动物日粮中含有一定量的纤维素有助于反刍行为，对于维持反刍动物瘤胃内环境的稳定具有一定作用。粗脂肪作为一种高能量物质，能够提高日粮的适口性[26]。粗蛋白是评价青贮饲料饲用价值的重要基础，能够提供动物所需的蛋白质[1]。近年来，青贮玉米饲料在畜牧业中的应用越来越广泛。研究表明，使用青贮玉米饲喂奶牛能够提高奶牛的产奶量，显著提高牛乳中的乳蛋白含量[27-28]。赵亚星等[29]、韩建成等[30]研究表明，合理饲喂青贮玉米饲料能够显著提高杜寒羊和黑山羊的平均日增重。Keady等[31]使用青贮玉米饲喂绵羊，发现绵羊的干物质采食量（DMI）、平均日增重（ADG）显著高于对照组。因此，青贮玉米饲料作为牛羊等反刍动物优质饲料的应用越来越广泛，科学合理地开发和利用青贮饲料是保证节粮健康型畜牧产业的重要手段。青贮玉米的产量和品质除了光照、温度、湿度等条件影响外，还会受到播种密度、种植方式、管理方式、施肥水平等的影响。本研究表明，拌种处理组的青贮玉米生物产量优于对照组。施加微生物菌剂可增加根际土壤中微生物数量，提高酶活性，促进植物对养分的吸收与利用[32-33]。本研究结果综合青贮玉米6 m2总重、单棵鲜重、干物质、粗蛋白、碳水化合物、灰分、钙磷钾等品质指标，证明微生物菌剂拌种能够有效改善青贮玉米的农艺性状、产量和品质，推测原因是荧光假单胞杆菌拌种改变了青贮玉米根际土壤微生物菌群结构，提高了优势菌属的丰度和有益微生物的含量，进而明显提高了青贮玉米的产量和品质。4结论本试验发现，荧光假单胞杆菌菌剂拌种明显提高了青贮玉米的生物产量和营养品质，促进根际土壤中有益微生物菌群的富集，提高了根际土壤微生物群落结构的多样性和丰富度。因此，微生物菌剂拌种可以作为提高青贮饲料品质的手段和方法，为推广应用高产、优质青贮玉米的栽培方式提供参考。