中草药具有毒副作用低、功能多样的优势，可作为抗生素替代品应用于动物生产[1-3]。蓝刺头为菊科蓝刺头属植物，分布广泛[4-5]，其根和花序均可入药。蓝刺头干燥根是中药“禹州漏芦”的主要成分，具有清热解毒、缓解疼痛、舒通筋脉、促进乳汁分泌等功效；其干燥花序则是蒙药“蓝刺头”，属蒙医常用药，味苦、性凉，存在固骨质、接骨愈伤等疗效，主要应用于治疗骨折、骨热、疮疡之疾病、刺痛症等疾病[6-7]。现代药理学研究发现，蓝刺头具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、杀虫、保肝等多种作用[8]。黄酮类化合物是蓝刺头主要成分之一，目前从蓝刺头属植物中共分离得到22类黄酮类化合物[9]。中药黄酮类化合物存在众多药理活性，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫和调节脂代谢等作用。杨斌等[10]研究发现，蓝刺头粗多糖可通过清除机体内部的羟自由基而产生抗氧化作用。萨茹丽等[11]研究发现，蓝刺头多糖提取物能够明显提升受试小鼠的免疫器官指数以及血清免疫球蛋白和细胞因子的含量。王岩[12]研究发现，蓝刺头多糖Ｂ对氧化损伤INS-1细胞具有保护作用。本试验选用内蒙古资源丰富的蓝刺头花序作为原材料，提取蓝刺头花序黄酮，灌服昆明小鼠，探讨蓝刺头黄酮对昆明小鼠的免疫和抗氧化功效，以期为蓝刺头黄酮在临床中应用提供参考。1材料与方法1.1药物和试剂蓝刺头黄酮粉末由内蒙古农业大学兽医学院临床兽医教研室提供，黄酮纯度为84.8%。免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，均购自北京华英生物技术研究所。1.2试验动物及饲料80只体重约（20±2） g的健康昆明小鼠购自内蒙古大学实验动物中心。小鼠试验日粮购自内蒙古大学实验动物中心，营养水平为粗蛋白≥19%、粗脂肪≥4.2%、粗纤维≤5%、粗灰分≤8%、钙1.0%~1.8%、磷0.5%~1.3%。1.3试验设计80只昆明小鼠在鼠房适应性饲喂7 d后，随机分为4组，每组20个重复，每个重复1只鼠。空白对照组小鼠灌喂蒸馏水，蓝刺头黄酮高剂量组小鼠灌喂400 mg/kg的蓝刺头黄酮，蓝刺头黄酮中剂量组小鼠灌喂200 mg/kg的蓝刺头黄酮，蓝刺头黄酮低剂量组小鼠灌喂100 mg/kg的蓝刺头黄酮。小鼠每日灌胃给药1次，连续给药30 d。1.4测定指标及方法1.4.1免疫器官指数试验结束，所有小鼠禁食24 h称重取样，其间小鼠可自由饮水。经眼球采血、脱颈处死后剖解，剥离胸腺和脾脏，称重，计算免疫器官指数。胸腺指数=胸腺重/体重(1)脾脏指数=脾脏重/体重(2)1.4.2血清免疫指标采用比色法测定小鼠血清IgA、IgG、IgM含量，酶联免疫吸附分析（ELISA）法测定小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量。依据相关试剂盒操作说明书进行操作。1.4.3血清抗氧化指标小鼠血清T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量、T-AOC采用比色法测定，具体测定步骤按照相关试剂盒操作说明书进行。1.5数据统计与分析数据初步采用Excel 2010软件进行整理，SPSS 20.0软件进行组间单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1蓝刺头黄酮对小鼠免疫器官指数的影响（见表1）由表1可知，与对照组相比，各剂量组小鼠胸腺指数、脾脏指数均有所升高，其中高剂量组小鼠胸腺指数显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.017.T001表1蓝刺头黄酮对小鼠免疫脏器指数的影响组别胸腺指数脾脏指数对照组1.62±0.06a3.13±0.20低剂量组1.66±0.08ab3.20±0.20中剂量组1.75±0.07ab3.31±0.20高剂量组1.85±0.09b3.42±0.30注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。mg/g2.2蓝刺头黄酮对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响（见表2）由表2可知，高剂量组小鼠血清IgG和IgA的含量显著高于对照组（P0.05），IgM含量略高于对照组（P0.05）；中剂量组小鼠血清中IgA含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.017.T002表2蓝刺头黄酮对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响组别IgGIgMIgA对照组2.76±0.21a0.52±0.811.62±0.09a低剂量组2.89±0.13ab0.46±0.071.68±0.14ab中剂量组3.00±0.19ab0.49±0.031.78±0.11b高剂量组3.15±0.17b0.56±0.041.75±0.07bg/L2.3蓝刺头黄酮对小鼠血清细胞因子水平的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，高剂量组小鼠血清IL-1β含量极显著降低（P0.01），IL-6和TNF-α的含量显著降低（P0.05）；中剂量组小鼠血清IL-1β含量极显著降低（P0.01），IL-6含量显著降低（P0.05）；低剂量组小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均略低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.017.T003表3蓝刺头黄酮对小鼠血清细胞因子水平的影响组别IL-6IL-1βTNF-α对照组136.47±7.42b103.42±9.15Bb72.66±5.64b低剂量组135.56±8.84b96.87±7.22Bb66.57±5.30b中剂量组121.62±7.38a87.10±6.52Aa65.92±3.05b高剂量组115.93±9.19a85.32±7.13Aa56.94±3.08ang/L2.4蓝刺头黄酮对小鼠血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，高、中、低剂量组小鼠血清SOD活性均显著高于对照组（P0.05），GSH-Px活性极显著高于对照组（P0.01）；高、低剂量组小鼠血清T-AOC极显著高于对照组（P0.01），中剂量组显著高于对照组（P0.05）；高剂量组小鼠血清MDA含量极显著低于对照组（P0.01），显著低于低剂量组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.017.T004表4蓝刺头黄酮对小鼠血清抗氧化指标的影响组别SOD/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)T-AOC/(U/mL)MDA/(μmol/L)对照组48.80±3.08a256.94±14.91Aa10.15±0.91Aa4.97±0.38Aa低剂量组64.44±4.71b288.30±12.06Bb13.85±1.14Bc4.42±0.27ABa中剂量组65.09±3.25b290.14±17.73Bb12.18±0.89Ab4.02±0.29ABab高剂量组72.32±6.47b315.82±15.23Bb14.36±1.17Bc3.86±0.26Bb3讨论3.1蓝刺头黄酮对小鼠免疫器官指数的影响动物中枢免疫器官由骨髓和胸腺组成，外周免疫器官包括淋巴结、脾脏和黏膜相关淋巴组织等。免疫T细胞在胸腺中分化并发育成熟，从而诱导免疫应答；而脾脏是免疫应答的重要场所之一，也是最大的外周免疫器官[13]。胸腺或脾脏细胞的增殖或萎缩可侧面反映机体免疫功能是否存在亢进或抑制[14]。因此，免疫器官指数常用做评价免疫水平的基础指标。胸腺和脾脏指数能够在一定程度上反映机体在面对病原时的免疫应答能力，客观体现试验用药物对其免疫功能的影响[15]。研究报道，长白山道地药材紫苏黄酮可影响小鼠免疫器官的生长发育，提高其胸腺及脾脏指数，增强免疫能力[16]。皮建辉等[17]研究表明，小鼠灌胃金银花黄酮后能够有效地提高各剂量组小鼠脏器指数。本试验结果显示，小鼠灌服不同剂量的蓝刺头黄酮30 d后，与对照组相比，各剂量组小鼠免疫器官指数均有不同程度升高；随着蓝刺头黄酮浓度增加，小鼠脾脏指数有升高趋势；高剂量组小鼠胸腺指数显著高于空白对照组，表明蓝刺头黄酮对提高小鼠免疫器官指数具有积极作用。3.2蓝刺头黄酮对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响免疫球蛋白是参与体液免疫的主要部分，由浆细胞分泌而成[18]。IgG、IgM、IgA可在一定程度上反映血清抗体的含量，其中IgG的含量最高，是体液免疫的主力军。IgA在血清中的含量仅次于IgG，是第一免疫防御的重要组成部分。而IgM主要来自脾脏以及淋巴结，具有强大的抗感染作用，是机体受到病原微生物入侵时最早产生的抗体[19]。张福欣等[20]报道，甘草黄酮可以显著提高小鼠血清中IgG含量。张石蕾[21]报道，睡莲花总黄酮可显著提高小鼠血清中IgM和IgG含量，从而发挥免疫调节作用。本试验结果显示，给试验小鼠服用蓝刺头黄酮，可增加小鼠体内免疫球蛋白含量，其中高剂量组小鼠IgG、IgM、IgA的含量均高于对照组，与上述研究报道结果一致，表明一定剂量的蓝刺头黄酮能够改善机体血清免疫球蛋白含量，增强小鼠免疫力。3.3蓝刺头黄酮对小鼠血清细胞因子水平的影响细胞因子是由机体免疫细胞和部分非特异性免疫细胞产生、合成的蛋白质或小分子多肽。细胞因子参与体液免疫的各个环节，能够促进免疫细胞的进一步分化和发育成熟，并在免疫应答过程中起一定调节作用。IL-1β是一个重要的细胞因子，涉及炎症及其他病理过程，但浓度过高反而会给机体带来负担。TNF-α和IL-6的存在可影响炎症以及免疫反应的发展进程，导致机体的直接损伤。而IL-1β正是加速TNF-α和IL-6产生的重要因素，高浓度的IL-1β能够刺激该部分细胞因子大量合成[21]。张石蕾[21]报道，睡莲花总黄酮可显著降低小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量，发挥免疫调节作用。本试验发现，3个蓝刺头黄酮剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均不同程度降低，其作用存在量效关系，高剂量和中剂量蓝刺头黄酮对小鼠的作用效果明显高于低剂量组。3.4蓝刺头黄酮对小鼠血清抗氧化指标的影响MDA是脂质发生过氧化反应的代谢终产物，其含量间接反映了机体内脂膜双层结构破坏和细胞损伤的程度，可作为反映机体内脂质过氧化水平的指标，而体内SOD、T-AOC和GSH-Px是机体内重要的自由基清除剂，可保护机体细胞不受自由基的损伤，其活性可间接反映机体消除自由基能力[22]。从天然中药材中提取的总黄酮可增强机体抗氧化能力，抑制过氧化现象的发生发展。如插田泡总黄酮[23]和沙冬青种子总黄酮[24]均能够从不同程度上明显提升小鼠SOD活性，显著降低MDA含量。本试验结果发现，蓝刺头黄酮可提高小鼠血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低MDA含量，在一定程度上帮助机体减缓脂质过氧化的发展，抑制脂质过氧化发生，与前人研究结果基本一致。综合相关研究结果，推测蓝刺头黄酮可能通过提高机体相关抗氧化酶的活性，从而发挥抗氧化作用，但具体机制仍有待进一步研究。4结论本试验结果表明，蓝刺头黄酮可提高昆明小鼠免疫器官指数，提高血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量，提高小鼠血清中SOD、GSH-Px的活性以及T-AOC，降低血清MDA含量，表明蓝刺头黄酮具有良好的抗氧化损伤作用，能够提升机体抗体水平，提高免疫能力。试验中添加400 mg/kg的蓝刺头黄酮效果较好，但今后的研究仍需进一步明确蓝刺头黄酮发挥抗氧化作用和提高免疫力的具体机制、最佳治疗剂量和最适周期，为蓝刺头总黄酮天然药物和相关保健饲料的开发研究提供参考。