黄姜花（Hedychium flavum Roxb.）生长在海拔900~1 200 m的山谷密林中[1]，是一种具备药用、食用及观赏价值的植物。黄姜花根茎为贵州苗药，又名夜寒苏，可用于治疗寒湿白带、体虚自汗、风湿筋骨疼痛、消化不良、感冒等病症[2]，但目前黄姜花还未得到广泛开发和利用。黄姜花中含有丰富的化学成分，其中黄酮类化合物、挥发性成分含量较高。王进喜等[3]从黄姜花根茎部位分离得到豆甾醇、异姜花素D、β-谷甾醇等8个化合物。近年来，关于黄姜花根部的化学成分提取的研究较多，但关于其黄酮类化合物鲜有研究，未见黄姜花茎活性物质的提取及研究。黄酮类化合物具有增强免疫力、抗肿瘤、促进胃肠道蠕动等多种作用[4]。研究表明，中草药提取的黄酮或以黄酮类化合物可作为畜禽饲料添加剂在动物生产中应用[5-7]。黄姜花通常以根部入药，而茎少许鲜嫩部位作为家畜食物，大部分被丢弃造成了极大的资源浪费。因此，从丢弃黄姜花茎中提取有效成分变废为宝，提高黄姜花的利用价值，优化自然资源具有重要意义[8]。本研究以黄姜花茎为原材料，以黄酮提取量为指标，利用超声辅助乙醇提取黄姜花茎黄酮，利用响应面设计优化黄姜花茎的黄酮提取工艺条件，为黔产药食两用植物黄姜花开发、利用提供参考。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器1.1.1试验材料黄姜花于2021年10月17日，在贵州省贵阳市花溪区石板镇羊龙村（北纬26°29'11''，东经106°36'44''，海拔1 220 m）采摘。1.1.2主要试剂无水乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司），芦丁标准品（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）。NaOH、亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。DPPH（上海麦克林生化科技有限公司），ABTS（萨恩化学技术上海有限公司）。1.1.3主要仪器PS-100A洁康超声波清洗机、恒温鼓风干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司），YP5102电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司），UH5300紫外分光光度计（日立高新技术公司），SHZ-D(Ⅲ)循环水多真空泵（巩义市科华仪器设备有限公司），ZN-100A微型粉碎机（中南制药机械厂），40目筛（上海上筛丝网制造有限公司）。1.2试验方法1.2.1黄姜花茎总黄酮提取工艺流程黄姜花茎→洗净烘干→粉碎，过40目筛→称取3 g粉末样品→不同体积分数乙醇溶液→超声辅助提取→抽滤→提取液。1.2.2黄酮含量测定黄姜花茎黄酮含量测定采用硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[9]。用芦丁作为标准对照品，在510 nm处测定不同梯度浓度芦丁溶液的吸光值，纵坐标Y为吸光度值、横坐标X为芦丁浓度，根据所得数据绘制芦丁标准曲线，得线性回归方程为Y=0.117 8X+0.019 6（R2=0.995 8）。计算黄酮得率。黄姜花茎黄酮得率=c×V×aM (1)式中：c为标准曲线计算得出的黄酮浓度（mg/g）；V为提取液体积（mL）；a为稀释倍数；M为黄姜花茎粉末质量（g）。1.3单因素试验以黄姜花茎黄酮提取率为指标，考察不同乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、不同温度（30、40、50、60、70 ℃）、不同液料比（10、20、30、40、50、60 mL/g）和不同提取时间（20、30、40、50、60 min）对黄姜花茎黄酮提取率的影响。1.4响应面试验设计结合单因素试验结果，使用Box-Behnken进行试验设计，选取液料比（A）、温度（B）、提取时间（C）和乙醇浓度（D）进行响应曲面分析试验。响应面因素水平设计见表１。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.T001表1响应面因素水平设计水平A/(mL/g)B/℃C/minD/%-1105020700206030801307040901.5黄姜花茎黄酮提取物体外抗氧化测定1.5.1DPPH自由基清除能力测定参照文献[10]稍做修改，将最佳提取工艺下得到的黄姜花茎黄酮提取液稀释为0、0.025、0.050、0.075、0.100 g/L的样品溶液，分别精确量取5 mL不同浓度梯度的黄姜花茎黄酮提取液加入至5 mL DPPH工作液均匀混合，避光静置30 min，在517 nm处测定吸光值A1，用5 mL无水乙醇代替DPPH工作液作为空白组，测得吸光值A2，用5 mL无水乙醇代替不同质量浓度黄酮提取物作为空白组，测定混合液吸光值为A0，用维生素C（VC）作为阳性对照，计算DPPH自由基清除能力。DPPH自由基清除能力=[1-(A1-A2)/A0]×100%(2)1.5.2ABTS自由基清除能力测定参照文献[2]和文献[10]稍做修改，精密称取19 mg ABTS和33 mg K2S2O8，甲醇定容至50 mL棕色容量瓶中，作为储备液于室温下避光12 h。试验前将储备液稀释成工作液，要求在734 nm波长下测得的吸光度为0.70±0.02。将最佳工艺下提取得到的黄酮提取物分别稀释为0、0.025、0.050、0.075、0.100 g/L的样品溶液，分别量取2 mL不同浓度梯度的黄酮样品液，加入4 mL ABTS工作液，摇匀后静置于室温反应6 min，在734 nm处测定吸光值A1，用无水乙醇代替不同浓度黄酮提取液作为空白组，测得吸光度A0，用VC作为阳性对照，计算ABTS自由基清除能力。ABTS自由基清除能力=(A1-A2)/A0×100%(3)1.6数据统计与分析试验数据采用Excel 2019、Origin 2018软件进行处理分析，利用Design expert 8.0.6软件进行响应面分析，每组试验均重复3次后取平均值。2结果与分析2.1单因素试验测定结果2.1.1液料比对黄姜花茎黄酮提取量的影响（见图1）由图1可知，随着液料比增加，黄姜花茎黄酮提取量呈先增加后减少的趋势；当液料比为20 mL/g时，黄姜花茎黄酮提取量达到最高；当液料比超过20 mL/g后，黄姜花茎黄酮提取量呈下降的趋势，可能是液料比上升导致脂溶性物质和醇溶性杂质溶出增加，从而影响总黄酮的浸出，提取率下降[11]。因此，黄姜花茎黄酮提取的最佳液料比为20 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F001图1液料比对黄姜花茎黄酮提取量的影响2.1.2乙醇浓度对黄姜花茎黄酮提取量的影响（见图2）由图2可知，在乙醇浓度为50%~80%之间时，黄姜花茎黄酮提取量呈上升趋势；当乙醇浓度上升到80%时，黄姜花茎黄酮提取量达到最大值；乙醇浓度超过80%时，提取量反之降低。因此，黄姜花茎提取黄酮的最佳乙醇浓度为80%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F002图2乙醇浓度对黄姜花茎黄酮提取量的影响2.1.3温度对黄姜花茎黄酮提取量的影响（见图3）由图3可知，当温度在30~60 ℃之间时，黄姜花茎黄酮提取量呈上升趋势；温度升至60 ℃时，黄姜花茎黄酮提取量上升至最大值，超过60 ℃后提取量降低。原因可能是温度太高导致黄姜花茎黄酮性质不稳定，使黄姜花茎黄酮提取量降低[12]。因此，黄姜花茎黄酮提取的最佳温度为60 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F003图3温度对黄姜花茎黄酮提取量的影响2.1.4提取时间对黄姜花茎黄酮提取量的影响（见图4）由图4可知，当提取时间在20~30 min之间时，黄姜花茎黄酮提取量呈上升趋势；当提取时间达到30 min时，黄姜花黄酮提取量上升至最高；时间超过30 min时，黄酮提取量反而下降，这也许是因为提取时间太长，某些杂质的分解导致黄姜花茎黄酮含量溶出较少[8]。因此，黄姜花茎黄酮提取的最佳时间为40 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F004图4提取时间对黄姜花茎黄酮提取量的影响2.2响应面优化试验2.2.1响应面试验结果及分析在单因素试验的基础上，通过黄姜花茎黄酮得率作为响应值，根据响应面试验优化黄姜花茎黄酮的提取工艺，结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.T002表2响应优化试验结果试验号A/(mL/g)B/℃C/minD/%黄姜花茎黄酮提取量/(mg/g)11050308020.0423050308016.7831070308031.6443070308028.5052060207039.9762060407021.2572060209036.5982060409035.0291060307040.70103060307036.59111060309042.99123060309042.02132050208017.14142070208029.70152050408014.49162070408025.60171060208027.29183060208040.09191060408034.29203060408020.65212050307015.57222070307022.94232050309024.75242070309047.82252060308043.84262060308044.56272060308045.04282060308045.28292060308035.142.2.2黄姜花茎黄酮提取量模型建立与分析运用Design Expert 8.0.6数据分析软件对试验数据进行多元回归拟合，设液料比、温度、提取时间和乙醇浓度分别为A、B、C、D，以黄姜花茎黄酮提取量为响应值进行多元回归拟合，方差分析结果见表3，二次多项回归模型为Y=42.77-0.84A+6.66B-3.08C+4.56D+0.030AB-6.61AC+0.79AD-0.36BC+3.92BD+3.64CD-2.95A2-13.77B2-8.68C2-0.67D2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型2 733.8014195.2712.470.000 1A8.3818.380.540.476 5B532.271532.2734.000.000 1C113.521113.527.250.017 5D249.721249.7215.950.001 3AB3.60×10-313.60×10-32.30×10-40.988 1AC174.771174.7711.170.004 8AD2.4612.460.160.697 5BC0.5310.530.030.857 2BD61.62161.623.940.067 2CD53.13153.133.390.086 7A256.27156.273.590.078 8B21 230.2111 230.2178.590.000 1C2489.221489.2231.250.000 1D22.9012.900.190.673 6残差219.141415.65失拟项145.121014.510.780.657 5纯误差74.02418.50总和2 952.9528注：1.R2=0.925 8，RAdj2=0.851 6。2.P0.05表示影响显著；P0.01表示影响极显著。由表3可知，回归模型P值小于0.000 1，失拟项P=0.657 50.05，表明该回归模型误差相对较小；同时模型回归系数R2=0.925 8，调整决定系数R2Adj=0.851 60.800 0，表明85.16%的数据可用，方程可靠性较高。模型显著性分析得出，一次项B、D对黄姜花茎黄酮提取量具有极显著影响（P0.01），提取时间C对黄姜花茎黄酮提取量具有显著影响（P0.05），一次项A对黄姜花茎黄酮提取量没有显著影响（P0.05），交互项AC对模型无显著影响（P0.05），AB、BD、AD、BC、CD为模型无显著影响（P0.05）。二次项B2、C2为模型极显著因素，其余均为不显著因素。根据F值分析各因素的主效应关系为BDCA。2.2.3各因素的交互作用分析根据回归方程结果，分析响应面曲面图及等高线图的形状，判断液料比（A）、温度（B）、提取时间（C）和乙醇浓度（D）对黄姜花茎黄酮提取量的影响。不同因素交互作用对黄姜花茎黄酮提取量的影响见图5。图5不同因素交互作用对黄姜花茎黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F5a1（a）液料比和提取温度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F5a2（b）液料比和提取时间的交互作用由图5可知，液料比和提取时间的交互作用显著（P0.05)，其余因素交互作用不显著（P0.05），与方差分析结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F5a3（c）液料比和乙醇浓度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F5a4（d）提取温度与提取时间的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F5a5（e）提取温度与乙醇浓度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F5a6（f）提取时间与乙醇浓度的交互作用2.2.4验证试验结果根据回归方程模型，得到黄姜花茎黄酮提取最优条件为液料比14.22 mL/g、提取温度62.72 ℃、提取时间32.27 min、乙醇浓度89.58%，将该条件修正为液料比15 mL/g、提取温度63.0 ℃、提取时间32.5 min、乙醇浓度90.0%。在此最优条件下，经3次平行试验得出实际黄姜花茎黄酮提取量与预测值总黄姜花茎黄酮提取量相差较小，证实了预测值和实验值之间的良好相关性。2.3黄姜花茎黄酮提取物体外抗氧化活性测定2.3.1黄姜花茎黄酮提取液对DPPH自由基清除能力（见图6）由图6可知，在样品质量浓度为0~0.1 g/L时，黄姜花茎黄酮提取物与VC对DPPH自由基的清除能力随着浓度的升高而上升；在质量浓度为0.1 g/L时，VC对DPPH自由基的清除能力为99%，黄姜花茎黄酮对DPPH自由基的清除能力也达到了93%，说明黄姜花茎黄酮提取液对DPPH自由基具有较强的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F006图6黄姜花茎黄酮提取液对DPPH自由基清除能力2.3.2黄姜花茎黄酮提取液对ABTS自由基清除能力（见图7）由图7可知，在样品质量浓度为0~0.1 g/L时，黄姜花茎黄酮提取物与VC对ABTS自由基的清除能力随着浓度的升高而上升，且黄姜花茎黄酮提取物与VC对ABTS自由基的清除能力相当；当质量浓度为0.1 g/L时，VC对ABTS自由基的清除能力为32%，黄姜花茎黄酮提取物对ABTS的清除能力为28%，说明黄姜花茎黄酮提取液对ABTS自由基具有较好的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.022.F007图7黄姜花茎黄酮提取液对ABTS自由基清除能力3讨论黄酮类化合物是一种多酚类物质，具有抗炎、抗氧化、抗癌、增强机体免疫力等功能[13]。研究表明，在日粮中添加黄酮类化合物可提高动物免疫力，调节肠道菌群、脂质代谢[14]，提高家禽生长性能，改善血清中的抗氧化性[15]。目前，如何从天然植物中高效提取黄酮化合物、保持黄酮的活性是研究的重点[16]。超声波法提取黄酮类物质是一种简便、高效的提取方法，在天然黄酮类化合物工业中具有一定的推广潜力[17]。响应面法可直观地分析出提取最佳条件，并且能够考虑到多种因素间的交互作用[18]，已广泛应用于提取工艺条件的优化研究中[19]。有学者通过响应面优化得出生姜茎叶中黄酮含量为15.42 mg/g[20]，并且生姜茎叶具有较高的瘤胃降解率，是一种优质的饲料资源[21]。有学者研究姜科植物草果、砂仁茎叶提取物可增强比格犬肠胃运动[22]，姜科植物艳山姜提取物对小鼠急性胃溃疡有保护作用[23]，具有牲畜饲料添加剂的潜能。同为姜科药食两用植物黄姜花的茎作为饲料以及饲料添加剂的研究至今还未见，但黄姜花茎中含有大量的黄酮化合物，具有作为畜禽饲料添加剂的潜力，可提高黄姜花茎的附加价值。4结论本试验以姜科药食两用植物黄姜花茎为试验对象，利用响应面设计对黄酮提取工艺进行优化，在最佳优化条件下对提取液进行抗氧化性分析。通过响应面优化方法得到最佳提取工艺条件为液料比15 mL/g、提取温度63.0 ℃、提取时间32.5 min、乙醇浓度90%，在此最佳条件下，黄姜花茎黄酮提取量为47.97 mg/g。在最佳提取条件下，黄姜花茎黄酮提取物对DPPH自由基、ABTS自由基具有较强的清除能力，说明黄姜花根茎酮提取物具有较好的抗氧化性，可为姜科药食两用植物资源黄姜花开发利用提供参考。