准噶尔山楂（Crataegus songarica）是新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市天山区野果林中的一种落叶小乔木，为蔷薇科山楂属植物，是中国优先保护物种名录中的三级重点保护植物[1-2]。近年来，山楂属植物及其提取物已经作为纯天然的中草药饲料添加剂应用于畜禽养殖中[3-4]。多糖是以醛糖或酮糖为主要单位的一种物质，大多数以一种天然高分子聚合物的结构存在于生物体中。多糖作为畜禽饲料添加剂具增强动物免疫能力、降血糖血脂及延长动物寿命等生物活性[5-7]。李孝平等[8]指出，山楂多糖具有抑制胃癌细胞增殖的作用；钟丽霞等[9]指出，山楂多糖有降血糖、降血脂等功效；马雪等[10]指出，准噶尔山楂多糖可延缓小鼠因D-半乳糖引起的衰老。但目前尚未见对准噶尔山楂中多糖的提取工艺及其抗氧化活性的研究。因此，本文采用苯酚-硫酸法检测准噶尔山楂中的多糖并对其含量进行测定[11]，利用响应面法优化提取准噶尔山楂多糖的最佳提取工艺条件，并对其多糖的抗氧化活性进行研究，为准噶尔山楂多糖在新型绿色饲料的开发利用和深入研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料准噶尔山楂采摘于新疆维吾尔自治区伊犁州霍城县大西沟乡。葡萄糖标准品（上海士锋生物科技有限公司）、无水乙醇（天津市北联精细化学品开发有限公司）、石油醚、丙酮（天津市致远化学试剂有限公司）、正丁醇（天津市光复科技发展有限公司）、浓硫酸（西陇科学股份有限公司）等均为分析纯；大孔树脂AB-8（上海将来实业股份有限公司）；透析袋（上海士锋生物科技有限公司）。1.2试验仪器UV-2500型紫外分光光度计（日本岛津公司），YB-500A型粉碎机（永康市速锋工贸有限公司），TDZ5-WS型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），XH-2000型电脑智能温控低温超声波合成萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司），Hei-VAP precision G3型旋转蒸发仪（德国海道尔夫公司），PSA124S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），LGJ-10N型真空冷冻干燥仪（北京亚星仪科科技发展有限公司），IR prestige-21型傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司）。1.3测定指标及方法1.3.1准噶尔山楂预处理新鲜的准噶尔山楂去核后阴干，粉碎成粉末，过筛，分别用石油醚和95%乙醇浸泡，除去脂肪、单糖、双糖、低聚糖及部分小分子物质，通风晾干，密封袋储存[12-13]。1.3.2准噶尔山楂多糖的提取工艺流程称取一定量预处理的准噶尔山楂粉末→加入适量的蒸馏水超声波提取→离心、去沉淀、取上清液→浓缩为原体积的1/4→加乙醇到浓缩液中，使乙醇体积达到80%→离心、取沉淀、去上清液→沉淀依次用丙酮、乙醚等洗涤→冷冻干燥→得到准噶尔山楂粗多糖。1.3.3准噶尔山楂多糖得率的计算以葡萄糖为对照品，在400~600 nm波长条件下进行紫外光谱扫描，确定准噶尔山楂多糖的最大吸收波长[14]。苯酚-硫酸法测定准噶尔山楂多糖含量。精密称取2.0 g准噶尔山楂粉末于100 mL锥形瓶中，在液料比20 mL/g、提取功率200 W、提取温度60 ℃、提取时间30 min、提取次数2次条件下进行单因素试验。考察不同的液料比（5~30 mL/g）、提取功率（100~600 W）、提取温度（40~90 ℃）、提取时间（10~60 min）、提取次数（1~6次）对多糖得率的影响。准噶尔山楂多糖得率=c×n×Vm×1 000 (1)式中：c为准噶尔山楂多糖溶液的浓度（g/L）；n为准噶尔山楂多糖的稀释倍数；V为准噶尔山楂多糖的溶液体积（mL）；m为准噶尔山楂多糖样品的质量（g）。1.3.4响应面试验设计（见表1）为进一步优化准噶尔山楂多糖的提取工艺条件，在单因素试验的基础上，以准噶尔山楂多糖得率为响应值，以提取时间（A）、提取温度（B）、提取功率（C）、液料比（D）为自变量，设计4因素3水平试验，对准噶尔山楂多糖的超声提取工艺进行优化。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.T001表1响应面试验因素水平设计水平A/minB/℃C/WD/(mL/g)－1307010010040802001515090300201.3.5准噶尔山楂多糖的纯化工艺流程准噶尔山楂粗多糖→大孔树脂AB-8脱色→Sevage试剂脱蛋白→流动水透析12 h→冷冻干燥→精制准噶尔山楂多糖→在200~800 nm进行紫外光谱扫描，鉴定纯度。1.3.6傅里叶变换红外光谱测定称取1.0~2.0 mg精制准噶尔山楂多糖和100 mg溴化钾放入玛瑙研钵中磨成细粉末，压片，在4 000~400 cm-1之间进行红外光谱扫描[15]。1.3.7准噶尔山楂多糖抗氧化活性的研究1.3.7.1DPPH自由基清除率的测定参考Ma等[16]试验的方法，分别量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的精制准噶尔山楂多糖溶液各1.0 mL至试管中，向各试管中加入3.0 mL的DPPH自由基溶液，摇晃均匀，避光30 min，反应完成后在紫外光谱517 nm处测定[17]。按照公式（2）计算精制准噶尔山楂多糖对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率=(1-Ai-AjA0)×100% (2)式中：Ai为样品组/VC的吸光度；Aj为无水乙醇代替DPPH自由基溶液的吸光度；A0为空白组的吸光度。1.3.7.2ABTS自由基清除率的测定参考Chen等[18]试验的方法，分别量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的精制准噶尔山楂多糖溶液各1.0 mL至试管中。向各试管中加入5.0 mL ABTS自由基溶液，摇晃混匀，反应完成后在紫外光谱734 nm处测定。按照公式（3）计算精制准噶尔山楂多糖对ABTS自由基的清除率。ABTS自由基清除率=(1-Ai-AjA0)×100% (3)式中：Ai为样品组/VC的吸光度；Aj为无水乙醇代替ABTS自由基溶液的吸光度；A0为空白组的吸光度。1.3.7.3羟基自由基清除率的测定参考Zhou等[19]试验的方法，分别量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的精制准噶尔山楂多糖溶液各1.0 mL至试管中。向各试管中加入6 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，再向各试管中加入6 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL，避光10 min，向各试管中加入6 mmol/L的水杨酸溶液1.0 mL，摇匀静置30 min，反应完成后在紫外光谱510 nm处测定。按照公式（4）计算精制准噶尔山楂多糖对羟基自由基的清除率。羟基自由基清除率=(1-Ai-AjA0)×100% (4)式中：Ai为样品组/VC的吸光度；Aj为蒸馏水替换水杨酸的吸光度；A0为空白组的吸光度。1.3.7.4铁离子还原能力的测定参考Rozi等[20]试验的方法，分别量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的精制准噶尔山楂多糖溶液各1.0 mL至试管中。先向各试管中加入0.2 mol/L pH值=6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和1%的K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL，混匀，在50 ℃水浴锅中反应20 min，取出后流水冷却，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL后，混匀，4 000 r/min离心5 min，取上清液5.0 mL于试管中，0.1%的FeCl3溶液1.0 mL，室温下静置10 min，反应完成后在700 nm处测定，按照公式（5）计算精制准噶尔山楂多糖的铁离子还原能力：铁离子还原力=Ai-Aj (5)式中：Ai为样品组/VC的吸光度；Aj为用蒸馏水替换FeCl3溶液的吸光度。1.4数据统计与分析所有的试验数据结果均重复3次，利用表格软件Excel、响应面软件Design-Expert 12.0.3及Origin 8.0进行数据处理和绘制图表。2结果与分析2.1最大吸收波长的确定结果（见图1）由图1可知，在400~600 nm范围内，准噶尔山楂多糖溶液和葡萄糖溶液的最大吸收波长为490 nm，因此选择490 nm为测定准噶尔山楂多糖含量的最大吸收波长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F001图1最大吸收波长的确定结果2.2单因素试验结果2.2.1液料比对准噶尔山楂多糖得率的影响（见图2）由图2可知，液料比在5~15 mL/g范围内时，随着溶剂增加，准噶尔山楂多糖的最大得率达到4.27%；液料比大于15 mL/g时，多糖得率随着溶剂的增加而减小。多糖的溶出与其接触面积和纯质动力都可能有关。溶剂增加接触面积增加，当溶剂增加到一定体积时，多糖溶出量达到平衡。因此，最佳液料比选取15 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F002图2液料比对准噶尔山楂多糖得率的影响2.2.2提取功率对准噶尔山楂多糖得率的影响（见图3）由图3可知，提取功率在100~200 W范围内时，准噶尔山楂多糖得率随着超声功率的增大而增加，最大多糖得率达到4.08%；提取功率大于200 W，多糖得率随着超声功率增大而降低，原因可能是超声波的空化作用会破坏多糖的结构。因此，最佳提取功率选取200 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F003图3提取功率对准噶尔山楂多糖得率的影响2.2.3提取温度对准噶尔山楂多糖得率的影响（见图4）由图4可知，提取温度在40~80 ℃范围内时，准噶尔山楂多糖得率随着提取温度的增大而增加，最大多糖得率能达到4.21%；提取温度大于80 ℃，多糖得率随着提取温度的增大而降低，原因可能是高温会破坏多糖的结构。因此，最佳提取温度选取80 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F004图4提取温度对准噶尔山楂多糖得率的影响2.2.4提取时间对准噶尔山楂多糖得率的影响（见图5）由图5可知，提取时间在10~40 min范围内时，准噶尔山楂多糖得率随着提取时间增大而增加，最大多糖得率能达到4.12%；提取时间大于40 min，多糖得率随着提取时间增大而降低。原因可能是超声波的空化作用会破坏植物细胞壁，随着时间的增大，超声波在高温、高频率下会破坏多糖结构，导致多糖得率减小。因此，最佳提取时间选取40 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F005图5提取时间对准噶尔山楂多糖得率的影响2.2.5提取次数对准噶尔山楂多糖得率的影响（见图6）由图6可知，提取次数在1~6次范围内时，准噶尔山楂多糖得率随着提取次数的增大而增加，最大多糖得率达到4.13%；提取次数大于2次，多糖得率基本持平，原因可能是准噶尔山楂原材料中的多糖已经完全溶出。因此，最佳提取时间选取2次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F006图6提取次数对准噶尔山楂多糖得率的影响2.3响应面试验结果2.3.1响应面试验设计及结果为确定本试验的准噶尔山楂多糖得率的最佳提取工艺条件，试验利用响应面软件Design-Expert 12.0.3中Box-Behnken试验设计4因素3水平的试验，以多糖得率（Y）为响应值，试验设计方案及结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.T002表2Box-Behnken试验设计及结果试验号ABCD多糖得率/%1-10013.72-10-103.05310014.3741-1003.9650-1014.1460-1-104.12700115.01800005.31900005.451010-104.641111003.881201-104.39续表2　Box-Behnken试验设计及结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.T003试验号ABCD多糖得率/%13-11004.5114-1-1003.291500-1-13.781600005.381700005.331800005.1319-100-13.392010104.152101014.692200-114.7423010-14.01240-1104.4250-10-13.982601104.3127-10104.3128100-13.6429001-14.17对表2试验数据进行二次多项回归拟合，获得准噶尔山楂多糖得率对提取时间（A）、提取温度（B）、提取功率（C）、液料比（D）的多元回归方程为：Y=5.320 0+0.115 8A+0.241 7B-0.075 8C+0.306 7D-0.325 0AB-0.187 5AC+0.105 0AD-0.340 0BC+0.130 0BD-0.165 0CD-0.866 7A2-0.517 9B2-0.219 2C2-0.650 4D2该模型的方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.T004表3回归模型方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型10.67140.762 316.100.000 1A0.480 010.480 010.140.006 6B0.300 810.300 86.350.024 5C0.218 710.218 74.620.049 6D1.130 011.1323.840.000 2AB0.422 510.422 58.920.009 8AC0.756 910.756 915.990.001 3AD0.044 110.044 10.931 50.350 8BC0.032 410.032 40.684 40.422 0BD0.067 610.067 61.430.252 0CD0.003 610.003 60.076 00.786 8A²5.360 015.360 0113.260.000 1B²2.030 012.030 042.840.000 1C²0.969 810.969 820.490.000 5D²2.080 012.080 044.000.000 1残差0.662 8140.047 3失拟项0.606 0100.060 64.270.087 3净误差0.056 840.014 2总差11.330 028注：1.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.R2=0.941 5。由表3可知，影响准噶尔山楂多糖得率的因素由大到小依次为：液料比提取时间提取温度提取功率。根据试验回归模型方差分析，模型P0.000 1，失拟项P=0.087 30.05，表明该试验模型拟合好，试验成立，试验数据具有意义。2.3.2各因素交互作用对准噶尔山楂多糖得率的影响（见图7）根据Design-Expert 12.0.3软件中Box-Behnken系统，作出响应面图及等高线图。由图7可知，超声时间与超声温度或超声功率的三维曲面图坡度较陡且等高线呈明显的椭圆形，表明AB、AC交互项对准噶尔山楂多糖的得率影响极显著。提取时间与液料比、提取温度与提取功率或液料比、提取功率与液料比的三维曲面图坡度较平缓且等高线相对于接近圆形，表明AD、BC、BD、CD交互项对准噶尔山楂多糖的得率影响均不显著。上述分析结果与方差分析结果一致。图7各因素交互作用对准噶尔山楂多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F7a1（a）提取时间与提取温度对准噶尔多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F7a2（b）提取时间与提取功率对准噶尔山楂多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F7a3（c）提取时间与液料比对准噶尔山楂多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F7a4（d）提取温度与提取功率对准噶尔山楂多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F7a5（e）提取温度与液料比对准噶尔山楂多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F7a6（f）提取功率与液料比对准噶尔山楂多糖得率的影响2.3.3准噶尔山楂多糖提取工艺的验证试验利用Box-Behnken设计试验得出准噶尔山楂多糖的最佳提取工艺条件为：提取时间40.76 min、提取温度81.45 ℃、提取功率210.33 W、液料比16.46 mL/g。结合实际试验操作将提取工艺条件简化为：提取时间41 min、提取温度82℃、提取功率210 W、液料比17 mL/g。按照此条件提取3次，平均多糖得率为5.36%。实际操作结果与理论值5.39%结果接近。结果表明，该试验的模型拟合好，可用于准噶尔山楂多糖的提取工艺。2.3.4准噶尔山楂多糖的紫外光谱扫描分析（见图8）由图8可知，精制准噶尔山楂多糖在260和280 nm处均无明显吸收峰，说明精制准噶尔山楂多糖不含蛋白质和核酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F008图8准噶尔山楂多糖紫外光谱分析2.3.5准噶尔山楂多糖的红外光谱扫描分析（见图9）由图9可知，一般来说，在3 200~3 600 cm-1区间内的吸收峰为O—H的伸缩振动峰，精制准噶尔山楂多糖在3 459.67 cm-1处有很强的宽而钝且强度大的峰，表明有O—H的伸缩振动吸收峰，提示存在分子间或分子内氢键；在3 000~2 800 cm-1范围内为饱和碳原子上亚甲基—CH2—的C—H键的反对称伸缩振动峰，精制准噶尔山楂多糖在2 937.05 cm-1附近有吸收峰，为多糖的特征性吸收峰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F009图9准噶尔山楂多糖红外光谱分析精制准噶尔山楂多糖在1 612.19 cm-1处吸收峰是糖酮类C=O（—COOH）的伸缩振动吸收振动引起。1 400~1 300 cm-1处的吸收峰是—CH3基的伸缩振动引起，精制准噶尔山楂多糖在1 394.28 cm-1的峰为饱和的C—H变角振动吸收峰。1 114.65 cm-1是糖环中C—O—C伸缩和变角振动引起的峰，吡喃糖环上C—O—H的特征吸收峰；1 054.94 cm-1处出现的吸收峰表明多糖主链可能有糖醛酸的存在，由吡喃糖环上C=O的伸缩振动引起；930~700 cm-1为环振动吸收区，858.17 cm-1的吸收峰为α-D-吡喃糖苷的C—H伸缩振动导致，表明精制准噶尔山楂多糖具有多糖的官能团，符合吡喃糖的特征。2.3.6准噶尔山楂多糖的抗氧化活性测定结果2.3.6.1准噶尔山楂多糖对自由基的清除能力（见图10~图12）由图10~图12可知，精制准噶尔山楂多糖浓度在0.1~1.0 g/L时，其对自由基的清除率随着多糖浓度的增大而增加，呈正相关性。当精制准噶尔山楂多糖浓度达到1.0 g/L时，多糖溶液对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的清除率分别为49.86%、39.11%、45.35%。虽低于同浓度的VC溶液对自由基的清除率，但表明精制准噶尔山楂多糖具有良好的抗氧化活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F010图10准噶尔山楂多糖对DPPH自由基的清除能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F011图11准噶尔山楂多糖对ABTS自由基的清除能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F012图12准噶尔山楂多糖对羟基自由基的清除能力2.3.6.2准噶尔山楂多糖对铁离子的还原能力（见图13）由图13可知，精制准噶尔山楂多糖溶液浓度在0.1~1.0 g/L范围内时，精制准噶尔山楂多糖溶液可将K3[Fe(CN)6]中的Fe3+还原成Fe2+，并且随着多糖浓度增大，准噶尔山楂多糖溶液还原能力也得到增强。准噶尔山楂多糖溶液的还原能力虽低于相同浓度的VC溶液，但仍具有良好的还原能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.013.F013图13准噶尔山楂多糖对铁离子的还原能力3讨论近年来，现代养殖业发展迅速，切实保障动物产品的品质，严格落实食品安全成为重中之重[21]。饲料作为畜禽养殖业的重要组成部分之一，其安全问题不容忽视。20世纪中期开始，抗生素因具有促进畜禽的生长和有效地预防疾病发生的优势加入动物饲料中，但其长期使用会产生耐药性[22]。而植物活性成分作为一种新型的绿色饲料添加剂，与抗生素相比，具有绿色、安全的优势。其中植物多糖因具有改善动物抗氧化能力、调节动物的免疫能力、促进动物生长等功效，被广泛应用于畜禽养殖业。目前，植物多糖的主要提取方法包括索氏提取法、溶剂提取法、超声波提取法及微波辅助提取法等。超声波提取法因其方法操作简单、提取时间短及提取率高等特点，已广泛应用于中草药有效成分的提取[23]。因此，本试验采用超声波提取法提取准噶尔山楂多糖，其多糖得率为5.36%，与张玉等[24]研究报道的多糖得率相比略高，可能与山楂产地及提取方法等多种因素有关。同时，本研究结果表明，准噶尔山楂多糖作为一种天然的植物活性成分具有较好的抗氧化能力，后续可开发为绿色饲料添加剂应用于畜禽养殖中。4结论本试验在单因素的基础上，利用Box-Behnken设计优化提取工艺条件，以多糖得率为响应值。各因素对试验的影响依次为：液料比提取时间提取温度提取功率。准噶尔山楂多糖最佳的提取工艺条件为提取时间41 min、提取温度82 ℃、提取功率210 W、液料比17 mL/g，实际准噶尔山楂多糖的得率为5.36%。准噶尔山楂多糖浓度在0.1~1.0 g/L范围内，对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的清除能力分别达到49.86%、39.11%、45.35%，并且对铁离子具有一定的还原能力，表明多糖浓度在0.1~1.0 g/L的范围内，与其抗氧化活性呈正相关，具有良好的抗氧化活性。准噶尔山楂多糖作为一种天然的植物活性成分，具有多种药用价值。本文开展准噶尔山楂多糖提取工艺的优化及抗氧化活性的研究，结果可为将来工业化开发准噶尔山楂多糖作为畜禽养殖饲料添加剂提供一定的依据。