家禽养殖中使用中草药类饲料添加剂，不仅能够提高家禽的生长性能、改善其肉质和蛋品质，而且对细菌、病毒等疾病的预防也具有显著作用[1]。连翘果实提取物具有清热解毒能力，其在饲料中的应用得到广泛研究[2-4]。与连翘果实相比，连翘的非药用成分连翘叶的研究与应用较少。研究表明，连翘叶与连翘果实成分相似，具有抗氧化、抑菌、降脂、抗病毒等多种药理作用[5]，富含营养元素且食用安全[6]。连翘叶在抑菌[7]和抗氧化[8]方面甚至优于连翘果实提取物，而较好的抗氧化和抑菌特性是中药饲料添加剂发挥促生长和预防疾病的重要基础[9-10]，表明连翘叶在饲料添加剂领域具有较好的开发潜力。为实现连翘叶的开发利用并充分发挥其作用，需对其进行质量研究。对于非药用部位连翘叶，药典尚未规定明确的质量标志物和质量标准，其活性物质含量与实际药理活性之间的相关性有待研究。本研究选取连翘叶最具针对性的抗氧化和抑菌活性，将连翘叶指纹图谱与药效结合[11]，通过谱效关系研究，评估十堰地区连翘叶质量，优选最佳产地，初步确定其抗氧化、抑菌活性物质基础，以期为十堰地区连翘叶功能饲料添加剂的开发提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器连翘酯苷A（批号：wkp18012210）、连翘苷（批号：wkp19010907）、芦丁（批号：wkp18100801）对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司，ABTS（批号：202006，纯度≥98%）购自上海宝曼生物科技有限公司，甲醇（色谱纯）购自美国Thermo Fisher，冰乙酸（批号：D1828093，纯度≥99.9%）购自阿拉丁试剂，其他化学试剂均为分析纯，所有水均为超纯水。金黄色葡萄球菌由武当特色中药研究湖北省重点实验室提供。连翘叶于2020年5月采摘自十堰地区十个产地（具体采摘地点见表1），经湖北医药学院中药学教研室主任张晓燕鉴定为木樨科连翘属植物连翘［Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl］的叶子。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.T001表110批连翘叶采摘地点编号采摘地点编号采摘地点1十堰市金堂村6十堰市麻家渡2十堰市黄龙庙7十堰市三官洞3十堰市十字沟8十堰市青石村4十堰市化龙堰9十堰市龙山镇5十堰市南化塘10十堰市绞肠关ThermoUtimate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher）、色谱柱（C18 Column 250×4.6 mm，5 μm，美国Waters）、RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、真空冷冻干燥箱（美国Labconco）、GR60DA立式自动压力蒸汽灭菌器（致微仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1连翘叶水提物的制备将各产地连翘叶阴干后粉碎，过60目筛。分别称定各产地连翘叶粉末15 g，14倍水回流2次，每次1 h，滤过，合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到干燥浸膏，称量，置于干燥器中保存。1.2.2连翘叶指纹图谱研究1.2.2.1供试品及对照品溶液的制备称定各产地连翘叶粉末15 g，14倍水回流提取2次，每次1 h，滤过，合并滤液，从中取5 mL置于25 mL容量瓶中，得供试品溶液1；称定“1.2.1”项下各产地连翘叶水提液干燥浸膏，加30%甲醇溶于容量瓶中，摇匀后定容，制成15 g/L溶液，得供试品2。精密称取适量连翘酯苷A、连翘苷、芦丁对照品，加甲醇溶于10 mL容量瓶中，摇匀并定容，得到连翘酯苷A、连翘苷、芦丁浓度分别为4.15、2.01、2.45 g/L的对照品储备溶液，低温避光保存。1.2.2.2连翘叶含量测定及HPLC指纹图谱的构建色谱柱为Waters-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相：A相为0.5%冰醋酸，B相为甲醇，梯度洗脱：0~10 min，28%~30% B；10~23 min，30%~37% B；23~36 min，37%~47% B；36~60 min，47%~80% B。进样量：5 μL，检测波长277 nm，流量1 mL/min，柱温：35 ℃。将“1.2.2.1”项下供试品1、供试品2以及对照品溶液在12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用0.22 µm微孔滤膜过滤，注入仪器进样，记录色谱图结果。重复3次，取平均值。1.2.3连翘叶水提物连翘酯苷A、连翘苷、芦丁得率的测定精密吸取“1.2.2.1”项下连翘酯苷A、连翘苷、芦丁对照品储备液2.40、2.49、2.04 mL置于10 mL容量瓶中，摇匀，甲醇定容，即得连翘酯苷A、连翘苷和芦丁浓度分别为1.0、0.5、0.5 g/L的混合对照品，再依次准确吸取2、4、6、8、10 mL混合对照品溶液置于5个10 mL容量瓶中，甲醇定容，得连翘酯苷A浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，连翘苷和芦丁浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的混合对照品溶液。按照“1.2.2.2”项下色谱条件进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X为横坐标，绘制标准曲线。主要成分得率的计算：W=c×D×Vm×100%(1)式中：W为主要成分得率（%）；c为根据HPLC峰面积计算出的溶液质量浓度（g/L）；D为溶液稀释倍数；V为供试品溶液体积（mL）；m为药材取样量（mg）。1.2.4方法学考察1.2.4.1精密度试验精密吸取“1.2.3.1”项下混合标准品溶液，按照“1.2.2.2”项下色谱条件重复进样6次，记录连翘酯苷A、芦丁和连翘苷峰面积并计算RSD值。1.2.4.2重复性试验取7号产地连翘叶粉末，按“1.2.2.1”项下方法平行制备6份连翘叶供试品溶液，按“1.2.2.2”项下色谱条件进样，记录连翘酯苷A、芦丁和连翘苷峰面积并计算RSD值。1.2.4.3稳定性试验取7号产地连翘叶粉末，按“1.2.2.1”项下方法平行制备6份连翘叶供试品溶液，分别在2、4、6、8、10、12 h按照“1.2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录连翘酯苷A、芦丁和连翘苷峰面积并计算RSD值。1.2.4.4加样回收率试验取7号产地连翘叶粉末，按“1.2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，将其稀释到适宜浓度，精密加入一定量的对照品溶液，按“1.2.2.2”项下色谱条件进样测定，计算连翘酯苷A、连翘苷和芦丁百分百回收率。1.2.5不同产地连翘叶水提物的抗氧化活性的测定本试验采用ABTS+自由基清除法测定[12]。将“1.2.1”项下不同产地的连翘叶干燥浸膏加水配制成浓度为20~500 mg/L的溶液作为待测样品。将7.4 mmol/L的ABTS溶液与2.6 mmol/L K2S2O8等体积混合，室温避光放置12~16 h，用超纯水稀释到适宜浓度即得ABTS工作液。于96孔酶标板中分别加入不同浓度的待测样品20 μL和ABTS工作液150 μL，充分混匀后，室温避光放置6 min，于734 nm处测得吸光值A样，用超纯水替换待测样品溶液，测得空白组吸光度值为A0。重复8组试验，计算ABTS+清除率。ABTS+清除率=A0-A样A0×100% (2)式中：A0为空白组吸光度值；A样为样品组吸光度值。以清除率对样品浓度作图，计算在ABTS+清除率为50%时的样品浓度，即IC50值。1.2.6不同产地连翘叶水提物抑菌效果的测定1.2.6.1连翘叶水提液制备称定“1.2.1”项下不同产地连翘叶水提物粉末0.15 g，置于10 mL容量瓶中，加入30%甲醇超声处理5 min，放冷，定容后摇匀，滤过，即得浓度为15 g/L的连翘叶溶液，再取其中4号样品溶液将其稀释为2.5、5.0、10.0、15.0 g/L。1.2.6.2菌液制备吸取预先活化好的金黄色葡萄球菌0.1 mL，将其置于15 mL灭菌的LB液体培养基中，混合均匀后于37 ℃摇床内恒温振荡培养18 h，菌悬液稀释，稀释后的金黄色葡萄球菌OD600 nm为0.18±0.01。1.2.6.3抑菌试验本试验采用牛津杯法[12]并改进。取“1.2.6.2”项下已稀释菌悬液，以固体培养基∶菌悬液=12.5∶1的比例混合制成平板。静置片刻至充分干燥，在其上放置灭菌牛津杯，轻轻按压使其与含菌培养基无缝贴合，向牛津杯内加入“1.2.6.1”项下连翘叶水提物溶液100 μL。30%甲醇做空白对照，平板37 ℃培养16~18 h，观察抑菌情况，并用游标卡尺十字法测量抑菌圈直径。试验重复6次，取平均值。1.3数据统计与分析试验数据采用灰色关联度法、利用Excel软件进行处理，采用主成分分析法、利用SPSS 23软件进行处理。2结果与分析2.1不同产地连翘叶指纹图谱相似度评价（见图1、图2）由图1可知，共标定13个共有峰。在供试品特征图谱中指认3个特征峰，分别为峰8（连翘酯苷A）、峰9（芦丁）、峰11（连翘苷）。图1连翘叶水提液和混合对照品的HPLC图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.F1a1（a）连翘叶水提液10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.F1a2（b）混合对照品将色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012）”，对10个产地的连翘叶水提物进行相似度比较，结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.F002图2连翘叶水提物HPLC指纹图谱注：S1~S10表示1~10号产地。由图2可知，1~10号产地样品与对照图谱之间的相似度为0.982~0.996，总体相似度良好，表明不同产地连翘叶水提物在有效成分及含量方面具有较高的一致性，符合指纹图谱研究要求。通过对比1~10号色谱峰，发现10号在6~8 min出现了两个非共有峰，且峰面积较大，情况特殊，在后续试验和统计中需要单独考虑。2.2连翘叶水提物连翘酯苷A、连翘苷、芦丁得率比较2.2.1主要成分标准曲线公式连翘酯苷A标准曲线公式：Y连翘酯苷A=30.491X-0.123 7，R2=0.999 8；连翘苷标准曲线公式：Y连翘苷=34.921X+0.091 9，R2=0.999 7；芦丁标准曲线公式：Y芦丁=58.114X+0.124 9，R2=0.999 5。结果表明，连翘酯苷A在0.2~1.0 g/L范围，连翘苷和芦丁浓度在0.1~0.5 g/L范围时，与峰面积呈良好线性关系。2.2.2连翘叶水提液多成分得率测定结果（见表2）不同产地连翘酯苷A、连翘苷、芦丁得率范围分别在4.45%~9.98%、1.17%~2.61%、1.05%~2.30%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.T002表2连翘叶水提液多成分得率测定结果产地编号连翘酯苷A连翘苷芦丁16.40±0.081.17±0.031.05±0.0324.52±0.081.41±0.031.40±0.0336.61±0.131.67±0.031.22±0.0249.98±0.142.34±0.052.30±0.0554.88±0.052.13±0.041.50±0.0368.98±0.131.25±0.021.78±0.0479.56±0.141.38±0.071.59±0.0388.53±0.092.60±0.062.29±0.0595.88±0.072.61±0.031.71±0.03104.45±0.081.90±0.061.63±0.04%2.3方法学考察结果连翘酯苷A、连翘苷和芦丁精密度RSD1%、稳定性RSD2%、重复性RSD3%，表明仪器精密度、12 h内供试品稳定性及方法重复性均良好。连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的加样回收率分别为96.10%~98.70%、95.43%~97.91%、95.10%~97.64%。2.4连翘叶抗氧化作用研究结果10个产地的连翘叶水提物浓度在20~100 mg/L范围内，其抗氧化活性随着浓度的增加呈线性上升，经拟合后R2在0.990 2~0.999 8区间内；浓度高于100~200 mg/L后增长速率减慢直至达到最高清除率。不同产地连翘叶水提物的IC50值见表3。由表3可知，10个产地样品抗氧化能力排序为：4≈87≈109≈6≈13≈25（≈表示统计学抗氧化能力无显著差异），化龙堰（4号）和青石村（8号）的连翘叶抗氧化能力明显高于其他产地。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.T003表310个产地连翘叶提取液对ABTS+自由基清除率的IC50结果产地编号IC50产地编号IC50178.28±1.22c677.93±0.73c280.49±1.15d772.14±1.24b380.50±1.17d866.53±0.81a465.14±1.14a976.48±1.49c583.67±1.22e1072.86±1.22b注：肩标不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。mg/L2.5连翘叶对金黄色葡萄球菌抑菌作用研究结果4号产地样品各浓度及空白对照对金黄色葡萄球菌抑菌圈大小见图3。由图3可知，各浓度抑菌圈呈现以药物为圆心的规则圆，且边缘清晰光滑。抑菌圈直径大小与浓度大小成正比，2.5、5.0、10.0、15.0 g/L对应的抑菌圈直径大小分别为8.82、11.32、14.96、16.28 mm。15.0 g/L浓度产生的抑菌圈边缘光滑清晰，大小稳定易测。因此，选用该浓度进行10个产地连翘叶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径的对比考察，结果见图4。牛津法测得的各产地抑菌圈结果见表4。由表4可知，10个产地样品抑菌能力排序为：84≈96≈101≈3≈725（≈表示统计学抑菌能力无显著差异），青石村（8号）、化龙堰（4号）、龙山镇（9号）的连翘叶抑菌能力明显高于其他产地。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.F003图3不同浓度连翘叶提取液对金黄色葡萄球菌抑菌圈注：A为15.0 g/L连翘叶提取液，B为10.0 g/L连翘叶提取液，C为5.0 g/L连翘叶提取液，D为2.5 g/L连翘叶提取液，E为30%甲醇。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.F004图410个产地连翘叶提取液对金黄色葡萄球菌抑菌圈10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.T004表410个产地连翘叶提取液对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径产地编号直径产地编号直径114.70±0.14d615.75±0.11c213.72±0.12e714.50±0.10d314.67±0.10d816.79±0.12a416.18±0.09b916.07±0.07b513.35±0.10f1015.63±0.14cmm2.6连翘叶13个峰与抗氧化、抑菌量效关联度结果（见表5）采用灰色关联度表示各因素之间的相关性强弱[13]。由表5可知，13个峰中有12个峰R值大于0.6，其中特征物质6号峰、8号峰（连翘酯苷A）、9号峰（芦丁）、11号峰（连翘苷）与抗氧化能力的关联度均为强相关（R0.8）；11号峰（连翘苷）与抑菌能力关联度为强相关（R0.8），9号峰（芦丁）、8号峰（连翘酯苷A）、6号峰、10号峰对其影响仅次于连翘苷（0.75R0.80）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.T005表5连翘叶13个峰与抗氧化、抑菌量效关联度结果序号（峰）抗氧化（R1）抑菌（R2）10.7930.74920.6660.63730.6730.65740.5820.53850.7240.68860.8520.77270.6480.6138（连翘酯苷A）0.8100.7819（芦丁）0.8400.791100.7630.75511（连翘苷）0.8240.831120.6820.647130.7490.7302.7主成分分析（PCA）选取灰色关联度（R）大于0.7的8个峰（1、5、6、8、9、10、11、13）进行主成分分析[14]，特征值大于1的3个主成分记为PCA（1~3），3个主成分累计贡献率达89.572%85%，表示可由这3个主成分变量反映连翘叶水提物成分整体信息。将这8个峰因子分析的每个主成分的成分矩阵系数进行转换，可得主成分分析的特征向量W（1~3）。W(1~3)=成分矩阵系数/sqrt(主成分相对应的特征值α) (3)将得到的特征向量W与原始值标准化之后的X相乘，可得每个主成分得分公式F1~F3。将8个峰变量转换成F1、F2、F3反映连翘叶水提物的整体情况。F1=0.465X1+0.454X5-0.335X6+0.376X8+0.385X9+0.060X10+0.351X11-0.223X13 (4)F2=0.174X1+0.236X5-0.122X6+0.355X8-0.260X9+0.595X10-0.287X11+0.518X13 (5)F3=-0.016X1-0.064X5-0.627X6+0.309X8-0.153X9-0.505X10-0.412X11+0.246X13 (6)式中：Xn为1~10号样品的第n号峰峰面积数值的标准化值。以每个主成分所对应的特征值（α）占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算主成分综合评价模型。F=α1α1+α2+α3F1+α2α1+α2+α3F2+α3α1+α2+α3F3 (7)式中：α1、α2、α3分别为每个主成分所对应的特征值。根据以上数据得出10个产地连翘叶水提液主成分得分及排名（见表6）。结果显示：8号（青石村）连翘叶样品主成分因子综合得分最高，其次为4号（化龙堰）、7号（三官洞）和6号（麻家渡）。5号（南化塘）和10号（绞肠关）连翘叶综合评分较低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.024.T006表610个产地连翘叶水提液主成分得分及排名产地编号F1F2F3F排名1-0.315-0.5850.506-0.24362-1.102-0.4391.319-0.51683-0.7420.553-0.805-0.423742.8960.8100.4971.95225-1.864-0.795-0.671-1.387960.0830.4340.6070.263470.0720.2841.8330.429383.6220.559-1.5221.95619-0.3560.539-0.613-0.172510-2.294-1.360-1.153-1.859103讨论3.1十堰地区连翘叶品质及开发潜力分析近年来，连翘叶的开发利用受到广泛关注，多篇文献表明，连翘叶可作为饲料添加剂促进动物生长[15-16]。目前，我国连翘主要产地为山西、河南、陕西等地，湖北十堰地区虽不属于传统连翘产区，但当地野生连翘资源丰富，显示出巨大的开采潜力。本课题组前期对十堰地区连翘进行了含量测定与活性研究，结果显示，湖北十堰产区连翘综合评分与山西、河南、陕西某些产区相当[17]，且其连翘叶水提物具有良好的抑菌与抗氧化效果[12]，显示出十堰地区野生连翘资源在饲料添加剂研究领域的良好潜力。为深入评估当地连翘叶品质，本文收集十堰地区10个产地的连翘叶，比较其含量及药理活性差异。结果表明，十堰各产地连翘叶有效成分含量高，其中青石村和化龙堰产地在含量与效果方面均明显优于其他产地。3.210个产地连翘叶的抗氧化和抑菌的谱效关系目前，无论是在生产还是在应用端，许多中草药饲料添加剂均缺乏相应的质量控制标准，极大地限制了中草药添加剂的推广和应用[18-19]。连翘叶受产地、收购季节等差异影响，其有效成分及药理作用存在差异，很难进行准确的药效控制。目前中国药典收录连翘果实（青翘、老翘）为其药用部位，并以连翘酯苷A、连翘苷的含量为其质量评价标准[20]。而连翘叶是非药用部位，药典并未收录。因此，以连翘叶抗氧化和抑菌能力为效应指标，确定其标志性成分含量与药效间的相关性，对十堰地区连翘叶饲料添加剂的质量控制具有重要意义。本文结合灰色关联度和主成分分析将测得的各产地共有峰含量变化与药理活性效果建立联系。GRA结果显示，13个峰中有12个峰R值均大于0.6，表明连翘叶抗氧化、抑菌活性为多成分作用的结果，其中1、6、8（连翘酯苷A）、9（芦丁）、11（连翘苷）号峰为强关联药效成分，上述结果与文献中各单体药效[21-23]研究及谱效关系研究[24]结果一致。主成分分析法弥补了灰色关联度法无法描述各峰对药效综合贡献度的缺点[11]，对各地连翘叶整体质量进行评估，最终排名与抗氧化、抑菌活性试验结论基本相符（10号样品排名异常），表明以1、5、6、8、9、10、11、13号峰构建的主成分综合评价模型可用于对连翘叶质量的总体评估。指纹图谱中连翘酯苷A、连翘苷、芦丁等3种成分峰面积大、出峰稳定且均为强关联药效基础成分，初步将这3种成分作为连翘叶的质量标志物。将各产地样本的3种成分的总体含量与抗氧化、抑菌效果相对应，发现其含量与效果大致呈正相关（10号样品异常），结果可为非药用成分连翘叶的质量标志物评定提供参考。同时，在实际生产中也可通过这几个标志成分的峰面积大小快速筛选相对优质的产地和品种，为连翘叶饲料添加剂作为抗生素替代物研究提供参考。其中，10号样品抗氧化、抑菌效果在10个产地中均较优，但连翘酯苷A、芦丁和连翘苷等多种有效成分含量均不高，对比HPLC指纹图谱，发现10号连翘叶在6~8 min内出现了两个连续的非共有峰，且峰面积较大，推测10号样品其较优的抗氧化抑菌活性可能与这两个成分相关，具体原因有待后续分析研究。4结论十堰地区连翘叶具有良好的抗氧化和抑菌性能，以青石村和化龙堰产地质量最优，在饲料添加剂领域拥有广阔的开发前景。连翘叶抗氧化、抑菌活性为多成分共同作用结果，其标志性成分连翘酯苷A、连翘苷、芦丁为强关联药效基础物质，可根据其含量进行连翘叶品质快速筛选。