目前，我国饲料行业存在蛋白饲料短缺的问题。我国超过60%的饲料蛋白由豆粕提供，其次由玉米蛋白粉、菜籽粕等提供。提高我国现有蛋白饲料原料的生物利用率是解决饲料蛋白资源短缺的有效途径。玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的主要副产物，其蛋白含量高达60%~70%，可被用作蛋白饲料。但是，玉米蛋白粉醇溶蛋白含量高，且含有大量疏水性氨基酸，导致其水溶性差，作为饲料使用时生物利用率偏低[1]。因此，如何提高玉米蛋白粉生物利用率是饲料行业亟待解决的关键问题。微生物发酵过程中产生的蛋白酶类能够将蛋白粉中大分子蛋白质降解，从而提高蛋白利用率。魏炳栋等[2]采用混菌发酵玉米蛋白粉，发酵液中粗蛋白含量提高了15.17%。本课题组前期研究发现，采用混菌固态发酵玉米蛋白粉时，发酵物可溶性蛋白含量由59.09 mg/g提高至103.55 mg/g[3]。日粮中添加10%玉米蛋白粉发酵饲料能够提高蛋鸡的生产性能，改善蛋品质[4]。与传统的微生物发酵相比，菌酶协同发酵可以更充分地降解饲料中难以消化吸收的物质，其产物具有抗营养因子含量低、目标产物得率高等特点。但是，酶制剂的加入导致发酵饲料成本提高。因此，本文以控制发酵饲料成本为前提，在低酶量条件下，采用枯草芽孢杆菌和酸性蛋白酶协同固态发酵玉米蛋白粉，提高其可溶性蛋白含量，进一步提高玉米蛋白粉的生物利用率，为制备高蛋白利用率的玉米蛋白粉发酵饲料提供参考。1材料与方法1.1原料与试剂酸菜，市售；玉米蛋白粉购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酸性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶购自沧州夏盛酶生物技术有限公司；碱性蛋白酶和复合蛋白酶购自Novozymes公司。1.2培养基脱脂乳粉筛选培养基：10%脱脂乳粉、2%琼脂，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。玉米蛋白粉筛选培养基：3%玉米蛋白粉、2%琼脂，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。1.3试验方法1.3.1菌株筛选及鉴定称取10.0 g酸菜，放入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，混合均匀后稀释，分别取10-3、10-4、10-5三个稀释梯度涂布于脱脂乳粉筛选培养基上，于37 ℃恒温培养箱倒置培养48 h。通过计算菌体直径/透明圈直径比值进行蛋白酶高产菌株的初筛。随后，将筛选的蛋白酶高产菌株点种在玉米蛋白粉筛选培养基上，于37 ℃下静置培养48 h。通过计算菌体直径/透明圈直径的比值进行复筛，最终筛选出可特异性降解玉米蛋白粉的菌株。以菌株基因组为模板进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳验证。随后将验证成功的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的序列在NCBI上进行同源序列比对，对其进行分析鉴定。1.3.2蛋白酶的筛选将膨化的玉米蛋白粉、小麦麸皮、豆粕和玉米胚芽粕以5∶2∶1∶2的比例混合作为制备发酵饲料的基质，将筛选到的菌种于LB培养基中过夜培养获取种子液。以发酵温度30 ℃、培养时间48 h，菌株接种量5%、物料含水量45%为发酵条件，将复合蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别以50 U/g加入基质中，在单向透气袋中进行生料固态发酵，以可溶性蛋白含量为指标筛选最适蛋白酶。1.3.3发酵条件的确定以发酵温度30 ℃、发酵时间48 h、物料含水量45%为初始发酵条件，研究加酶量、菌株接种量、含水量、发酵时间、发酵温度对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响。在单因素试验结果的基础上，确定影响可溶性蛋白含量显著的因素。以Box-Benhnken为设计原理设计响应面试验，以发酵饲料可溶性蛋白含量为指标，确定最佳发酵工艺条件。响应面试验因素及水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.T001表1响应面试验因素及水平设计水平A加酶量/(U/g)B含水量/%C接种量/%-150402010045511505081.3.4饲料营养成分分析按照GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2006、GB/T 6438—2007、NY/T 1459—2007、GB/T 18246—2000、DB15/T 1458—2018、GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002方法分别测定发酵饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、氨基酸、pH值、Ca和P含量；采用福林酚法和三氯乙酸法分别测定可溶性蛋白和多肽含量；采用SDS-PAGE分析饲料中蛋白质分子量分布。1.3.5发酵饲料抗氧化活性分析精确称取10.0 g玉米蛋白粉发酵饲料，溶解于装有80 mL蒸馏水的三角瓶中，振荡2 h，蒸馏水定容至100 mL，12 000 r/min离心20 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，冻干。参照文献[5]的方法检测发酵饲料对DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基的清除能力，以未发酵的饲料原料作为对照。1.4数据统计与分析采用Excel 2020软件对试验数据进行初步整理，利用GraphPad Prism 8.0 软件进行单因素方差分析，采用Tukey's法多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1特异性降解玉米蛋白的菌株筛选及鉴定（见表2、图1、图2）优良菌株是获得优质发酵目标产物的先决条件。玉米蛋白粉水溶性差，直接作为饲料使用时生物利用率低。微生物分泌的酶可以将玉米蛋白粉中大分子蛋白水解为小分子蛋白，进而提高其生物利用率。本试验采用脱脂乳粉平板初筛、玉米蛋白粉平板复筛的方法进行菌株的筛选。首先通过脱脂乳粉平板初步筛选出菌落直径与透明圈直径比值小于0.7的20株高产蛋白酶菌株，随后将这20株菌点种于玉米蛋白粉筛选平板进行复筛。结果表明，有10株菌能够降解玉米蛋白（见表2），其中A5号菌株水解玉米蛋白粉中的蛋白质能力最强（见图1）。16S rDNA序列分析结果显示，菌株A5与枯草芽孢杆菌EGI 110有99.52%的同源性（见图2），因此确定菌株A5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。枯草芽孢杆菌属于农业农村部规定的安全饲用微生物，本研究选用A5菌株用于后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.T002表2菌株在脱脂乳粉和玉米蛋白粉筛选培养基上的菌体直径（d）与透明圈直径（D）菌株编号脱脂乳粉培养基(d1/D1)玉米蛋白粉培养基(d2/D2)菌株编号脱脂乳粉培养基(d1/D1)玉米蛋白粉培养基(d2/D2)A10.63±0.120.96±0.09A140.62±0.120.91±0.12A30.59±0.070.98±0.09A150.65±0.090.96±0.15A40.66±0.050.83±0.07A170.66±0.060.88±0.03A50.59±0.040.73±0.08A180.68±0.080.93±0.12A90.69±0.190.86±0.06A200.63±0.050.95±0.0910.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F001图1菌株A5在脱脂乳粉和玉米蛋白粉筛选培养基上水解透明圈10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F002图2基于16S rDNA序列菌株A5的系统发育树2.2蛋白酶的筛选微生物发酵饲料制备生产时，外源酶的加入可以在一定程度上弥补微生物产酶不足的缺陷，使大分子物质降解程度提高，进一步提高饲料的生物利用率。选择中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶进行低水平的菌酶协同生料发酵饲料试验，酶的添加量均为50 U/g。酶种类对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响见图3。由图3可知，酸性蛋白酶与枯草芽孢杆菌协同发酵结果最好，发酵饲料可溶性蛋白含量明显高于其他蛋白酶类与枯草芽孢杆菌的协同发酵及枯草芽孢杆菌单独发酵的效果。这是由于玉米蛋白粉原料pH值为3.5~3.8，发酵饲料基质pH值为4.1，偏酸性的发酵基质最适宜酸性蛋白酶发挥作用（最适pH值为2.5~5.0）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F003图3酶种类对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响2.3菌酶协同发酵饲料条件的确定2.3.1单因素试验结果（见图4）2.3.1.1加酶量对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响饲料发酵过程中酶添加量过多促使饲料产生苦涩味道，同时增加饲料的生产成本。在低加酶量25~300 U/g条件下，探究加酶量对饲料中可溶性蛋白含量的影响，结果见图4（a）。由图4（a）可知，当加酶量为25~150 U/g时，发酵饲料的可溶性蛋白含量与加酶量呈正相关；当加酶量大于150 U/g时，随着加酶量的增加其可溶性蛋白含量有下降趋势并趋于恒定。考虑成本因素，选择100 U/g为其适宜加酶量。2.3.1.2接种量对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响适宜的接种量可以缩短发酵周期，同时还可以避免因接种量过大导致的基质养分过度消耗。接种量对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响见图4（b）。由图4（b）可知，当枯草芽孢杆菌接种量为3%~5%时，随着接种量的增加，发酵饲料可溶性蛋白含量呈增加趋势；当接种量大于5%时，可溶性蛋白含量呈下降趋势。因此，确定最合适的接种量为5%。2.3.1.3物料含水量对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响物料含水量是影响固态发酵饲料产品质量的重要因素。物料含水量较低时，菌体容易因缺水导致细胞破裂死亡，同时基质中营养物质传输受阻，微生物生长受限；物料含水量较高时，基质通透性降低，菌体因氧气供给不足导致生长受到抑制，影响产物得率。物料含水量对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响见图4（c）。由图4（c）可知，发酵饲料中含水量为30%~60%时，可溶性蛋白含量与含水量呈正相关。随着物料水分含量的增加，玉米蛋白粉吸水能力增强，营养物质溶解度增加，微生物合成蛋白酶效率提高，促使大分子蛋白降解为小分子蛋白速率增加。但是，当物料含水量较大时（50%~60%），饲料染菌率增加，且增加了后续干燥过程的能耗，提高了饲料的经济成本。综合考虑，选择物料含水量为40%作为适宜的发酵含水量。2.3.1.4发酵温度对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响发酵温度影响微生物产酶能力和添加的蛋白酶的活力，适宜的发酵温度对发酵饲料品质至关重要。发酵温度对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响见图4（d）。由图4（d）可知，在20~35 ℃范围内，发酵饲料可溶性蛋白含量呈递增趋势。当温度为35 ℃时，产物中可溶性蛋白含量达到最高，为132.2 mg/g。当温度高于40 ℃时，发酵饲料可溶性蛋白含量呈下降趋势。这是因为在35 ℃时，微生物生长代谢活动旺盛，蛋白酶生产效率增加，且当酸性蛋白酶处于其最适工作温度范围内（30~50 ℃）时，其催化大分子蛋白降解为小分子蛋白的反应速率增大。因此，确定35 ℃为最佳发酵温度。2.3.1.5发酵时间对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响饲料发酵时间过短，菌体对饲料原料降解不充分；发酵时间过长，生成的可溶性蛋白被菌体进一步分解利用，导致产物可溶性蛋白含量下降。发酵时间对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响见图4（e）。由图4（e）可知，发酵饲料可溶性蛋白含量随着时间的增加呈现先增加后下降的趋势，当发酵时间为120 h时达到最高值138.3 mg/g，但发酵72 h与120 h，发酵饲料中可溶性蛋白含量差异不显著（P0.05）。这主要是由于初始发酵时，微生物利用底物中充足的营养物质进行大量繁殖，蛋白酶产量迅速提高，加速了底物中非水溶性蛋白质向水溶性蛋白质的转化；随着发酵时间的延长，基质中残余的可利用营养物质减少导致微生物生长受限，微生物蛋白酶产量降低使底物中可溶性蛋白含量增加缓慢。江成英等[6]研究结果与本研究结果一致。因此考虑到时间成本因素，确定最适发酵时间为72 h。图4单因素试验结果注：相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F4a1（a）酶添加量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F4a2（b）接种量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F4a3（c）含水量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F4a4（d）发酵温度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F4a5（e）发酵时间2.3.2响应面试验结果在单因素试验结果的基础上，固定发酵时间和发酵温度，选取加酶量（A）、物料含水量（B）和接种量（C）3个因素为响应变量，以饲料的可溶性蛋白含量为指标，以Box-Behnken为设计原理设计响应面试验，考察加酶量、物料含水量、接种量及其交互作用对发酵饲料可溶性蛋白含量的影响。响应面试验结果见表3。对试验结果进行多元回归拟合，得到响应值为发酵饲料可溶性蛋白含量的二次回归模型：Y=137.34+0.27A+6.98B+8.07C-0.22AB+2.71AC-0.24BC-0.69A2-0.63B2-12.23C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.T003表3响应面试验结果试验号A加酶量/(U/g)B含水量/%C接种量/%可溶性蛋白含量/(mg/g)1100455135.36±1.232100408126.27±0.663100508138.27±0.784150505144.23±0.72550405127.38±0.756100455137.83±0.447100502123.16±0.698150452113.21±0.539100455136.97±1.091050458130.21±1.1211150405129.21±0.9812150458135.32±0.771350455118.93±0.8114100455138.76±1.0115100455137.78±0.771650505143.26±1.2317100402110.21±0.94对上述模型进行方差分析及回归模型系数显著性分析，结果见表4。结果显示，模型P0.000 1，表明模型极显著；失拟项P=0.381 90.05，说明模型拟合程度好，试验方法合理，可用来预测与分析加酶量、物料含水量和接种量3种因素对发酵饲料中可溶性蛋白含量影响的试验结果。回归模型R2=0.991 9，R2adj=0.981 4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.T004表4回归模型方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型1 586.489176.2894.900.000 1A0.6010.600.320.587 7B389.901389.90209.910.000 1C521.001521.00280.490.000 1AB0.1810.180.100.761 6AC29.32129.3215.790.005 4BC0.2310.230.120.737 7A22.0012.001.080.333 4B21.6711.670.900.374 5C2630.041630.04339.190.000 1残差13.0071.86失拟6.4932.161.330.381 9纯误差6.5141.63总和1 599.4816注：P0.05表示影响显著；R2=0.991 9、R2adj=0.981 4。通过F值可以判断影响发酵饲料中可溶性蛋白含量的3个因素的顺序为：CBA。通过P值检验回归系数的显著性，其中B、C、AC、C2对响应值影响显著（P0.05），其他因素组合对可溶性蛋白含量无显著影响（P0.05）。根据预测的模型得到二次回归方程的响应曲面图及等高线图，见图5。由图5可知，加酶量（A）和接种量（C）的交互作用对发酵饲料可溶性蛋白含量影响最显著，在3D曲面图表现为坡度较陡，等高线较密集，而加酶量（A）和含水量（B）的交互作用对发酵饲料可溶性蛋白含量影响不显著，3D曲线图较为平缓，等高线图较稀疏，这与方差的分析结果一致。图5各因素交互作用对可溶性蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F5a1（a）含水量和加酶量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F5a2（b）接种量和加酶量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F5a3（c）接种量和含水量响应面试验优化的玉米蛋白粉发酵饲料最优工艺条件为加酶量110.3 U/g、含水量49.4%、接种量6.1%。在此优化条件下，发酵饲料可溶性蛋白含量为144.4 mg/g。考虑实际操作，调整工艺条件为加酶量100 U/g、含水量45%、接种量5%。根据上述条件，进行3次平行试验，发酵饲料的可溶性蛋白含量达到140.1 mg/g。因此，该模型可用于对玉米蛋白粉发酵饲料可溶性蛋白含量随发酵条件变化情况进行预测。2.4发酵饲料成分分析2.4.1发酵饲料营养成分及pH值分析（见表5）由表5可知，与发酵前相比，发酵饲料中的可溶性蛋白含量提高了94.2%。主要是由于酸性蛋白酶与枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶协同发挥水解作用，使原有玉米大分子蛋白降解为具有一定空间结构的小分子蛋白，提高了玉米蛋白的溶解性。另一方面是由于枯草芽孢杆菌利用酸性蛋白酶的酶解产物和基质大分子物质合成新的蛋白类和酶类等营养物质，增加了基质可溶性蛋白含量。另外，研究表明，发酵饲料中可溶性蛋白含量的增加与枯草芽孢杆菌分泌的植酸酶、半纤维素酶等非淀粉多糖酶有关[7]。本研究发现，与发酵前相比，饲料中粗纤维和中性洗涤纤维含量分别降低了29.6%和11.0%，表明在发酵过程中，枯草芽孢杆菌产生了如半纤维素酶、植酸酶和β-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶类，水解粗纤维和中性洗涤纤维，降低饲料中非淀粉多糖类物质的抗营养性。申春莉等[8-9]采用纤维素、半纤维素酶活高的食用菌发酵豆渣，发现产生的纤维素酶和半纤维素酶能够分解纤维素和半纤维素，释放蛋白等营养成分，使发酵底物可溶性蛋白含量提高3.87倍。饲料经发酵后，粗脂肪和淀粉含量分别降低了18.7%和24.5%，表明枯草芽孢杆菌能够分泌脂肪酶、淀粉酶水解脂肪、淀粉等大分子物质，生成利于动物吸收的脂肪酸和葡萄糖等小分子物质，提高饲料品质[10-11]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.T005表5发酵饲料营养成分及pH值分析（干基）项目发酵前发酵后可溶性蛋白/(mg/g)72.13±1.43b140.10±1.78a粗蛋白/%41.32±0.1242.56±0.21粗脂肪/%3.95±0.07a3.12±0.09b粗纤维/%3.95±0.18a2.78±0.15b灰分/%3.28±0.153.24±0.11中性洗涤纤维/%22.23±0.22a19.79±0.18b酸性洗涤纤维/%7.78±0.177.76±0.13淀粉/%17.51±0.21a13.22±0.25bCa/%0.11±0.030.11±0.05P/%0.61±0.090.60±0.11pH值4.16±0.024.11±0.03注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）。2.4.2发酵饲料蛋白分子量分布及多肽含量分析（见图6）饲料中蛋白质分子量是反映其溶解性和生物活性的重要指标。饲料中小分子蛋白及多肽含量增加，有助于动物机体抗氧化能力和免疫力增强。由图6（a）可知，饲料发酵前，蛋白分子量主要分布在36~72 kDa之间，经过发酵后，发酵饲料主要蛋白分子量分布范围为小于28 kDa，且分子量小于17 kDa的蛋白含量显著增加。由图6（b）可知，饲料发酵后多肽含量为92.0 mg/g，与发酵前（52.8 mg/g）相比提高了74.3%。以上结果表明，菌酶协同发酵玉米蛋白粉可以将大分子玉米蛋白降解为小分子蛋白和多肽，提高玉米蛋白生物利用率。Jiang等[12]采用酸性蛋白酶和乳酸菌协同发酵玉米蛋白粉，其多肽含量和抗氧化能力显著提高，日粮中添加该发酵饲料能够提高断奶牛犊生长性能并缓解氧化应激反应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F006图6发酵饲料蛋白质分子量分布图及多肽含量注：M为标准分子蛋白；1为饲料发酵后；2为饲料发酵前。2.4.3发酵饲料氨基酸组成（见表6）由表6可知，饲料发酵后，各氨基酸含量均有不同程度的增加，总氨基酸和必需氨基酸含量分别增加97.9%和111.1%，说明饲料经发酵后，大分子蛋白被降解为氨基酸，饲料营养价值得到提升。Wang等[13]研究发现，玉米蛋白粉经发酵后，总氨基酸含量显著提高。本研究中，饲料发酵后，呈味氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分别增加106.6%、97.6%、106.7%、116.5%、72.9%和54.3%。呈味氨基酸含量的增加能够赋予饲料特殊的鲜味儿，使饲料适口性增加，进而提升动物采食量。Wang等[14]研究表明，发酵饲料谷氨酸和赖氨酸含量增加，提高了饲料鲜味和动物采食量。此外，本研究中疏水氨基酸如甲硫氨酸、缬氨酸的大量增加，有助于发酵饲料抗氧化活性的增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.T006表6发酵饲料氨基酸组成（干基）项目发酵前发酵后项目发酵前发酵后丙氨酸1，31.513.12赖氨酸2，40.510.66缬氨酸1，40.491.09组氨酸20.420.65亮氨酸1，41.473.48精氨酸20.400.82异亮氨酸1，40.380.69苏氨酸40.511.12脯氨酸12.214.01丝氨酸0.861.69甲硫氨酸1，40.110.31半胱氨酸0.060.12苯丙氨酸1，3，40.71.08总氨基酸13.8727.45谷氨酸32.124.38疏水氨基酸6.8713.78酪氨酸30.480.83碱性氨基酸1.332.13甘氨酸30.791.71呈味氨基酸6.4512.90天冬氨酸30.851.68必需氨基酸3.156.65注：1为疏水氨基酸；2为碱性氨基酸；3为呈味氨基酸；4为必需氨基酸。%2.4.4发酵饲料抗氧化活性分析（见图7）菌酶协同发酵饲料中含有大量生物活性物质，可以提高动物抗氧化能力、抗病力和免疫防御机能[15-16]。DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力被广泛用于评价物质的抗氧化能力。发酵饲料抗氧化活性分析见图7。由图7可知，饲料发酵后的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力显著增强，最高可达76.7%和82.3%，与发酵前相比分别提高32.8%和58.1%，表明玉米蛋白粉饲料发酵后具有更高的抗氧化活性。研究表明，多肽含量的增加与基质的抗氧化活性的增加有关，多肽分子量越小，其抗氧化活性越强[17]。赵丹等[18]发现，豌豆蛋白水解物分子量小于3 kDa组分的抗氧化活性高于分子量大于3 kDa的组分。Liu等[19]研究发现，采用复合酶水解玉米蛋白粉制备的多肽表现出很强的体外ABTS+自由基清除能力和活性氧清除能力。因此，推测发酵饲料多肽含量的显著增加是导致发酵饲料抗氧化活性增强的原因之一。此外，发酵饲料抗氧化活性与多肽中氨基酸组成有关，多肽序列C端相邻氨基酸残基为疏水氨基酸的多肽抗氧化活性高[20-21]。王彬彬等[22]研究表明，酶解后玉米谷蛋白的抗氧化活性显著增强，是由于酶解导致的产物中疏水性氨基酸增加引起的，推测发酵饲料抗氧化活性的增加与亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸的增加有关。图7发酵饲料抗氧化活性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F7a1（a）ABTS+自由基10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.010.F7a2（b）DPPH自由基3结论枯草芽孢杆菌与酸性蛋白酶协同发酵玉米蛋白粉可以显著提高饲料中可溶性蛋白含量，提高玉米蛋白粉的生物利用率和饲料营养价值。但本文主要研究了单一菌株和单一酶制剂协同发酵对玉米蛋白粉生物利用率的影响，后续将采用复合菌株和复合酶制剂协同发酵制备玉米蛋白粉饲料，深入探索复合菌和复合酶协同发酵作用机制。