旋扭山绿豆（Desmodium intortum）是一种热带亚热带多年生豆科牧草，具有适口性好、产量高、营养价值高的优点[1-2]。一般认为，豆科牧草的最佳青贮原料含水量在60%~75%左右[3]，而旋扭山绿豆牧草鲜草的含水量一般为80%左右，虽然晾晒一定时间可使鲜草的水分含量降到60%~75%，但华南地区多雨潮湿，易导致发霉腐烂。该牧草还具有缓冲能力（BC）较强、可溶性碳水化合物（WSC）含量低等特性，不利于制备高品质的青贮饲料。目前，对旋扭山绿豆牧草青贮的研究极少，因而解决高水分对旋扭山绿豆牧草青贮的不利影响具有重要意义。菠萝是凤梨属的一种常见热带水果，在华南等地广泛种植，菠萝果实收获后，大量的茎叶被直接丢弃焚烧或遗留在田间，没有得到充分利用[4]，造成了资源的浪费。菠萝叶单独青贮时易获得高品质青贮饲料[5]，所以菠萝的饲料化应用具有广阔前景。本研究拟通过旋扭山绿豆牧草与WSC含量较高的菠萝叶混贮，筛选出混合青贮的合适比例，建立该牧草的高水分青贮技术体系，旨在开发出华南地区替代苜蓿的本地化新型优质饲料原料，为促进养殖业的发展提供参考。1材料与方法1.1试验材料本试验所用旋扭山绿豆牧草采自广州市天河区华南师范大学牧草试验场；菠萝叶由广东省农业科学院果树研究所提供；植物乳杆菌株由华南师范大学牧草研究中心提供，活菌数为1.3×109 CFU/mL，使用前按体积比1∶9的比例与水稀释，添加量为1 mL/kg FW。旋扭山绿豆牧草与菠萝叶的营养成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.020.T001表1旋扭山绿豆牧草与菠萝叶的营养成分项目旋扭山绿豆牧草菠萝叶干物质/%18.32±0.1317.54±0.22粗蛋白/%DM20.85±0.208.20±0.06可溶性碳水化合物/%DM1.31±0.0919.25±0.45淀粉/%DM1.32±0.085.54±0.88中性洗涤纤维/%DM56.44±3.7260.61±2.51酸性洗涤纤维/%DM37.61±1.0330.13±0.35缓冲能力/(meq/kg DM)637.00±47.40377.00±73.50灰分/%DM7.52±0.321.53±0.061.2试验设计试验分为5组，每组3个重复。将新鲜收割的旋扭山绿豆牧草和菠萝叶切碎至1~2 cm，分别按100%牧草（CK组）、90%牧草+10%菠萝叶（10% PL组）、85%牧草+15%菠萝叶（15% PL组）、80%牧草+20%菠萝叶（20% PL组）和75%牧草+25%菠萝叶（25% PL组）的比例混合均匀，并接种植物乳杆菌，用15 cm×20 cm密封袋密封后在室温下发酵，每袋100 g，发酵至60 d后取样分析。1.3测定指标及方法参照德国农业协会青贮饲料感官评定标准[6]进行感官评价，采用FE28 pH计测定pH值，参照李旭娇[7]的方法测定粗蛋白（CP）、总氮（TN）、非蛋白氮（NPN）、氨态氮（NH3-N）含量，参照张丽英[8]的方法测定灰分（Ash）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量，采用乳酸滴定法测定缓冲能力（BC）[9]，采用蒽酮硫酸法测定可溶性碳水化合物（WSC）和淀粉（S）含量[10-11]，采用高效液相色谱法测定乳酸（LA）和丁酸（BA）含量[12]。1.4数据统计与分析采用Excel 2010软件对试验数据进行初步整理，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮感官评价（见表2）由表2可知，CK组青贮有刺鼻的焦酸味或臭味，且变色严重，茎叶结构保持较差，等级评价为中等；20% PL组、25% PL组有较强酸香味，色泽与原料相似且茎叶结构保持良好，等级评价为优良。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.020.T002表2旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮感官评价组别气味色泽质地等级CK组有刺鼻的焦酸味或臭味变色严重，呈黄色茎叶结构保持较差中等10% PL组较轻酸味，芳香味弱略有变色，呈淡黄色茎叶结构保持良好尚好15% PL组较强酸味，芳香味弱与原料相似茎叶结构保持良好优良20% PL组较强酸香味与原料相似茎叶结构保持良好优良25% PL组较强酸香味与原料相似茎叶结构保持良好优良2.2旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮前的营养成分（见表3）由表3可知，青贮前，两种原料的DM相近，混合后的各组青贮前DM含量相差不大。随着菠萝叶比例增加，Ash和CP含量呈降低趋势，25% PL组青贮前Ash和CP含量分别比CK组显著降低19.4%和19.7%（P0.05）；青贮前WSC和S的含量显著增加，其中25% PL组含量显著高于其他处理（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.020.T003表3旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮前的营养成分组别DM/%Ash/(g/100 g DM)WSC/(g/100 g DM)S/(g/100g DM)CP/(g/100g DM)NPN/(g/100 g TN)NDF/(g/100 g DM)ADF/(g/100 g DM)CK组18.32±0.13ab7.52±0.33a1.31±0.09a1.33±0.06a20.85±0.20a20.43±2.5856.44±3.7237.61±1.0310% PL组18.46±0.18a6.96±0.21b2.98±0.01b1.71±0.03b18.94±0.49b20.45±0.9158.96±1.2738.00±0.5615% PL组18.17±0.27ab6.67±0.31bc3.91±0.06c1.98±0.05c17.84±0.17bc22.07±0.4058.21±1.1737.09±1.8320% PL组18.30±0.25ab6.30±0.10cd4.81±0.05d2.09±0.04d17.21±0.37c21.88±0.3859.12±2.2237.75±0.2725% PL组17.98±0.24b6.06±0.20d5.59±0.03e2.31±0.03e16.74±1.61c22.07±1.4059.72±0.3236.95±0.34注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或者无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮60 d的营养成分（见表4）由表3、表4可知，旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮60 d后，各处理组青贮中WSC含量均出现了大幅下降。在发酵过程中，若S发生水解反应则可增加WSC的含量。与表3中青贮前S含量相比，CK组、10% PL组、15% PL组、20% PL组和25% PL组青贮S分别下降20.30%、36.84%、41.92%、38.28%和39.83%。CK组发酵后CP含量减少量最高，减少了8.59%，而20% PL组和25% PL组发酵后CP含量仅减少了3.72%和0.30%。发酵后各处理组的NDF含量均有下降，相比发酵前分别减少了16.58%、23.25%、20.10%、14.70%和13.93%。发酵60 d，25% PL组青贮NDF含量显著高于CK组（P0.05）。发酵前后，各组青贮ADF的含量变化均不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.020.T004表4旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮60 d的营养成分组别WSCSCPTNNDFADFCK组0.24±0.05ab1.06±0.02c19.06±0.76a3.05±0.12a47.08±2.40bc38.11±0.55a10% PL组0.23±0.06b1.08±0.13c18.14±0.95ab2.90±0.15ab45.25±1.01c37.63±1.54ab15% PL组0.31±0.03a1.15±0.16bc17.04±0.20bc2.73±0.03bc46.51±2.13c36.84±0.31ab20% PL组0.29±0.01ab1.29±0.00ab16.57±1.25c2.65±0.20c50.43±1.90ab37.43±0.27ab25% PL组0.30±0.04ab1.39±0.05a16.69±0.27bc2.67±0.05bc51.40±2.14a36.38±0.40bg/100 g DM2.4旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮60 d的发酵品质（见表5）由表5可知，随着菠萝叶的添加量增多，pH值下降越显著（P0.05）；10% PL组和15% PL组青贮的pH值虽显著低于CK组（P0.05），但仍处于4.30以上；当菠萝叶添加量在20%以上时，pH值均在4.30以下。与发酵前相比，CK组青贮NPN含量增加幅度最大，增加了40.19%，而10% PL组、15% PL组、20% PL组和25% PL组青贮中NPN含量分别增加了37.95%、15.59%、21.89%和22.79%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.020.T005表5旋扭山绿豆与菠萝叶混合青贮60 d的发酵品质组别pH值NPN/(g/100 g TN)NH3-N/(g/100 g TN)LA/(g/kg DM)BA/(g/kg DM)CK组5.08±0.05a28.64±0.854.47±0.10a24.99±4.42e28.3210% PL组4.53±0.06b28.21±2.462.75±0.09bc37.15±0.45dND15% PL组4.37±0.03c25.51±0.012.63±0.14bc52.10±4.79cND20% PL组4.24±0.10c26.67±2.062.84±0.30b63.97±8.05bND25% PL组3.93±0.10d27.10±2.152.48±0.17c79.27±1.39aND添加菠萝叶的处理组青贮中NH3-N含量均显著低于CK组（P0.05），且分别比CK组降低38.5%、41.3%、36.4%和44.5%。青贮中LA含量随着菠萝叶添加比例增加呈显著增加的趋势（P0.05），发酵后10% PL组、15% PL组、20% PL组和25% PL组的LA含量分别比CK组增加48.7%、108.5%、156.0%和217.2%。CK组青贮BA含量为28.32 g/kg DM，其他处理组均未检出BA。3讨论3.1旋扭山绿豆牧草与菠萝叶混合青贮的品质分析pH值是评价混贮品质的一项重要指标，低pH值的内部环境能够防止有害微生物的生长，使青贮饲料保存更长的时间[13]。本试验在旋扭山绿豆牧草中添加了不同比例的菠萝叶，青贮60 d后，pH值均显著下降，尤其当菠萝叶的添加量达到20%时，pH值降至4.20左右，这是一个较为理想的pH值水平，一般可判定此范围内处于稳定青贮[14]。在青贮发酵前期，植物乳杆菌发酵底物产生大量的有机酸，对pH值的降低起到关键作用。本研究表明，pH值下降与LA含量升高紧密相关。若青贮体系含水量过高，则易造成梭菌发酵，而梭菌发酵过程中产生的丁酸（BA）会严重影响动物的适口性与健康[15]。本研究中，纯旋扭山绿豆牧草青贮产物中检出BA，但添加菠萝叶杜绝了BA的产生，这也表明了旋扭山绿豆与菠萝叶高水分混贮成功。在常规青贮饲料评定体系中，NH3-N与TN的比值是一个重要的品质评判指标，品质越优良的青贮饲料其比值越小[16]。Wang等[17]将黄梁木叶分别与两种高水分含量的紫花苜蓿和柱花草混合青贮后，发现其NH3-N含量分别为110 g/kg TN和60.5 g/kg TN，在饲料评定体系V-Score评分准则中，NH3-N含量处于50g/kg TN以下可评定为优良[18]。在旋扭山绿豆牧草中添加菠萝叶发酵至60 d，尤其添加量大于20%时，CP损失率显著下降，且NPN含量的增加幅度明显小于CK组，表明了添加菠萝叶发酵能够显著降低蛋白质和氨基酸的进一步降解，有利于蛋白保存。综上所述，旋扭山绿豆牧草与菠萝叶混合后可以获得较好的青贮品质，且以20%PL组和25%PL组品质最佳。3.2旋扭山绿豆牧草与菠萝叶混合青贮成功的影响因素分析菠萝叶中高的可溶性碳水化合物（WSC）含量可能是混贮成功的关键因素。WSC是青贮中的重要发酵底物，有助于维持青贮的稳定性和酸度。在发酵前期，乳酸菌在厌氧环境下分解WSC，产生有机酸，从而迅速降低pH值，抑制有害微生物的生长，如梭菌和霉菌[19]。研究表明，若WSC含量占干物质的5%以上，可获得保存完好的青贮[20]。本研究中，旋扭山绿豆的WSC含量仅占干物质的1.31%，而菠萝叶的WSC含量则高达19.25%。混合青贮试验结果表明，当菠萝叶的添加量为20%，发酵前混贮的WSC含量为4.8%时，混贮的pH值和NH3-N含量较低，LA含量较高；发酵至60 d后，WSC基本消耗殆尽，此时混贮品质已经达到理想预期。其他研究也获得了类似的结果。田静等[21]研究发现，与对照组相比，DM含量为27%的旋扭山绿豆牧草单独青贮中添加乳酸菌和1%葡萄糖后，显著降低了pH值和NH3-N含量，增加LA含量，有效改善了旋扭山绿豆牧草的青贮品质。菠萝叶的BC可能也是混贮成功的重要因素。青贮原料的BC对发酵品质具有很大影响。BC越高，pH值下降越慢，导致有害菌的生存空间上升。有研究指出，蛋白质所起的缓冲作用在20%左右[22]，而旋扭山绿豆牧草中20.85%的CP含量要大幅高于菠萝叶中8.2%的CP含量。Ash中矿物质含量高也是导致缓冲能力高的主要原因之一[23]，而菠萝叶的Ash含量仅为1.53%。本研究结果表明，旋扭山绿豆具有较高的BC，因此青贮难度更大；而菠萝叶的BC仅为377 mEq/kg DM，仅为旋扭山绿豆牧草BC的59.18%，因此混贮后体系的BC相对减小，青贮更易成功。此外，菠萝叶中的淀粉酶也可能在发酵中发挥作用。本试验表明，发酵前后，添加菠萝叶的各处理组淀粉（S）含量的下降幅度明显大于CK组，因此推测菠萝叶中可能含有较高的淀粉酶活性，能够水解青贮体系中的部分S，为乳酸发酵提供额外的WSC。4结论本试验结果显示，旋扭山绿豆牧草与菠萝叶混合青贮可增加WSC和LA含量，降低pH值、NH3-N含量，并杜绝了BA的产生。结果表明，旋扭山绿豆牧草与菠萝叶混合青贮能够极大地改善旋扭山绿豆单独青贮存在的不足，且添加20%左右的菠萝叶与旋扭山绿豆混合青贮较为适宜。