玉米秸秆是重要的农业生产资源，可用作畜牧生产中的青贮饲料原料[1]。青贮饲料具有耐储存、营养价值高等优点，是反刍动物日粮的重要组成部分。研究表明，青贮饲料原料在储藏过程中易被真菌毒素污染，从而影响青贮品质和家畜的生产性能[2]。真菌毒素是丝状真菌二次代谢的副产物，广泛存在于食品与饲料基质中。许多农产品如谷物、水果和坚果等[3-5]均可能受到真菌毒素的污染，从而造成经济损失。真菌毒素会引起畜禽出现一系列健康问题，并在农畜产品（蛋、奶）中残留，通过食物链进入人体[6-9]。大多数真菌毒素具有致癌、致畸和遗传毒性，对人类健康构成风险[10-11]。由于真菌毒素的产生不可避免，且在粮食及其加工品、饲料中含量较低，因此，需要开发出高速、高灵敏度的检测方法[12]。常见的真菌毒素检测技术有高效液相色谱法[13]、液质联用技术[14]、气相色谱及质谱联用技术[15-16]、免疫分析法[17]等。近年来，能同时测定多种真菌毒素的高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）的发展受到了广泛关注，LC-MS/MS技术集中了色谱的分离性能与质谱的分子确证优势[18]，具有稳定性好、灵敏度高、专一性强等优点，已成为饲料中多种真菌毒素检测的主要方法。本研究针对玉米秸秆基质的特性以及20种真菌毒素的化学结构特点，通过优化QuEChERS净化方法，结合超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱法，建立了一种用于玉米秸秆饲料中20种真菌毒素的高通量检测技术。与其他方法相比，该方法可减少同位素内标的使用，降低检测成本，且样品提取净化方法简便[19-21]，适用于大批量玉米秸秆饲料中多种霉菌毒素的筛查，可为饲料真菌毒素污染调查提供有效的检测方法。1材料与方法1.1材料与试剂甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，中国上海安谱实验科技股份有限公司），甲酸98%（分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司），MgSO4（分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司）、PSA固相吸附剂（天津博纳艾杰尔公司）、C18硅胶吸附剂（天津博纳艾杰尔公司），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。黄曲霉毒素混标溶液，其中包含黄曲霉毒素B1(AFB1，2.0 mg/L）、黄曲霉毒素B2（AFB2，0.5 mg/L）、黄曲霉毒素G1（AFG1，2.0 mg/L）、黄曲霉毒素G2（AFG2，0.5 mg/L）；呕吐毒素混标溶液，其中包含脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，100 mg/L）、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Ac-DON，100 mg/L）、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-Ac-DON，100 mg/L）；T-2毒素（50 mg/L）；HT-2毒素（100 mg/L）；伏马毒素混合标准液，其中包含伏马毒素B1（FB1，50 mg/L）、伏马毒素B2（FB2，50 mg/L）、伏马毒素B3（FB3，50 mg/L）；玉米赤霉烯酮混标溶液，其中包含玉米赤霉酮（ZAN，100 mg/L）、玉米赤霉烯酮（ZEN，100 mg/L）、α-玉米赤霉醇（α-ZAL，100 mg/L）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZEL，100 mg/L）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL，100 mg/L）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZEL，100 mg/L）；赭曲霉毒素A（OTA，10 mg/L）；赭曲霉毒素B（OTB，10 mg/L）。以上真菌毒素标准品均购自奥地利Romer公司。1.2仪器设备LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司），QTRAP 5500质谱仪（美国SCIEX公司），5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），VORTEX 3涡旋混匀器（德国IKA公司），KQ-2500E超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司），ML-204精密天平（精度0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司），ZX-DC 24孔水浴式氮吹仪（北京众信佳仪科技有限公司）。1.3试验方法1.3.1样品前处理方法样品提取：样品采集后密封保存，每份样品混匀，称取500 g进行粉碎，过40目筛，于4 ℃冰箱中保存。使用时再次混匀，称取1.00 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-甲酸（95∶5）提取溶液，强烈涡旋振荡1 min，放入超声波清洗机中超声提取20 min，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，离心后的上清液待净化。样品净化：取5 mL离心后的上清液加入净化剂（100 mg MgSO4，100 mg PSA，150 mg C18）剧烈振荡1 min，使净化剂在样品提取液中充分混匀，4 ℃、8 000 r/min高速离心10 min，取2 mL上清液转移到5 mL离心管中，40 ℃水浴氮气吹至近干，加200 μL甲醇-水-甲酸（30∶70∶0.1）混合溶液复溶，涡旋振荡1 min，12 000 r/min离心12 min，上清液过0.22 μm PTFE滤膜，存储于进样瓶中。1.3.2溶液的配制真菌毒素混合标准溶液的配制：量取适量各种待测真菌毒素的标准溶液于10 mL容量瓶中，采用乙腈定容，配制混合标准储备液，充分涡旋混匀，置于-20 ℃冰箱内。基质匹配标准工作溶液的配制：使用未检出目标化合物的样品经提取、净化后的上清液作为溶液，取适量的混合标准储备液，采用逐级稀释法配制基质匹配标准工作溶液，基质匹配标准工作溶液需现用现配，具体配制梯度见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.T001表1基质匹配标准系列溶液中各真菌毒素浓度真菌毒素梯度1梯度2梯度3梯度4梯度5梯度6AFB11.002.004.0010.0020.0050.00AFB20.250.501.002.505.007.50AFG11.002.004.0010.0020.0050.00AFG20.250.501.002.505.007.50DON1.0020.0040.00100.00200.00500.003-Ac-DON1.0020.0040.00100.00200.00500.0015-Ac-DON1.0020.0040.00100.00200.00500.00FB14.008.0016.0040.0080.00200.00FB24.008.0016.0040.0080.00200.00FB34.008.0016.0040.0080.00200.00T-24.008.0016.0040.0080.00200.00HT-210.0020.0040.00100.00200.00500.00ZEN4.008.0016.0040.0080.00200.00α-ZEL4.008.0016.0040.0080.00200.00β-ZEL4.008.0016.0040.0080.00200.00ZAN4.008.0016.0040.0080.00200.00α-ZAL4.008.0016.0040.0080.00200.00β-ZAL4.008.0016.0040.0080.00200.00OTA4.008.0016.0040.0080.00200.00OTB8.0016.0032.0080.00160.00400.00μg/L玉米秸秆空白基质液配制：取经检测不含目标化合物的玉米秸秆样品，按照1.3.1方法制备空白基质溶液。1.4仪器方法1.4.1色谱条件色谱柱为Shiseido C18柱（100 mm×2.0 mm×3 μm）；流动相A为0.1%甲酸-水溶液；流动相B为甲醇溶液；流速为0.30 mL/min；进样量为10.0 µL。正负离子模式洗脱梯度见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.T002表2正负离子模式洗脱梯度测试类型时间/min流动相比例/%测试类型时间/min流动相比例/%ABAB正模式1.007030负模式1.09736.5045552.045558.5045559.0307010.00208010.019912.00208011.019912.01703011.197316.00703015.09731.4.2质谱条件电喷雾离子源（ESI），选择多反应监测（MRM）模式进行检测；离子喷雾电压分别设置为ESI+模式（5 500 V），ESI-模式（-4 500 V）；离子源温度设置为550 ℃；气帘气为35 psi；Gas1为50 psi，Gas2为55 psi；20种真菌毒素质谱参数见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.T003表320种真菌毒素质谱参数真菌毒素保留时间/min去簇电压（DP）/VMRM条件ESI模式定量离子定性离子离子对碰撞能量（CE）/V离子对碰撞能量（CE）/VAFB17.6395313.1/285.132313.1/241.150ESI+AFB27.09113315.1/287.135315.1/259.141ESI+AFG16.65110329.1/243.233329.1/214.943ESI+AFG26.03115331.1/245.139331.1/189.154ESI+3-Ac-DON4.3660339.0/203.012339.0/231.018ESI+15-Ac-DON4.5461339.1/137.217339.1/321.313ESI+DON1.8160296.9/249.112296.9/231.118ESI+FB19.04146722.5/334.353722.5/352.349ESI+FB211.51151706.5/336.349706.5/318.351ESI+FB310.93151706.5/336.349706.5/354.151ESI+T-212.3440484.2/185.118484.2/305.331ESI+HT-29.4266442.1/263.117442.1/215.019ESI+ZEN9.34-112317.1/175.0-31317.1/131.1-34ESI-ZAN9.01-112319.2/275.2-26319.2/205.1-30ESI-α-ZEL7.22-110319.2/160.1-36319.2/130.0-40ESI-β-ZEL8.92-110319.2/160.1-36319.2/130.0-40ESI-α-ZAL6.32-112321.2/277.2-28321.2/303.2-25ESI-β-ZAL8.33-112321.2/277.2-28321.2/303.2-25ESI-OTA9.66-80402.1/358.1-28402.1/166.9-47ESI-OTB7.38-30368.1/324.4-15368.1/214.9-17ESI-2结果与分析2.120种真菌毒素质谱条件的优化结果本研究在ESI+和ESI-模式下进行全扫描，分别将质量浓度为50 μg/L的20种真菌毒素标准溶液以针泵进样的方式进行注射分析，得到各自的母离子。母离子要求选择化合物相对分子质量附近的准分子离子峰，结果发现有12种真菌毒素在ESI+模式下灵敏度和响应强度更高，有8种真菌毒素在ESI-模式下灵敏度和响应强度高于ESI+。对母离子进行二级扫描得到子离子，每种真菌毒素选取两对灵敏度和稳定性高的特征离子对分别作为定量、定性离子对，通过改变去簇电压（DP）及碎裂能（CE）等质谱条件得到各目标化合物的最佳出峰状态，分别得到20种真菌毒素在ESI+和ESI-模式下的MRM色谱图，见图1、图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F001图1ESI+模式下12种真菌毒素总离子流色谱结果注：1为DON，2为3-Ac-DON，3为15-Ac-DON，4为AFG2，5为AFG1，6为AFB2，7为AFB1，8为FB1，9为HT-2，10为FB3，11为FB2，12为T-2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F002图2ESI-模式下8种真菌毒素总离子流色谱结果注：13为α-ZAL，14为α-ZEL，15为OTB，16为β-ZAL，17为β-ZEL，18为ZAN，19为ZEN，20为OTA。2.2提取溶剂优化结果2.2.1提取溶剂中水的使用对真菌毒素回收率的影响（见图3）真菌毒素化学结构性质存在差异，提取溶剂通常选择有机溶剂和水的混合溶液[22]，乙腈作为提取溶剂能够提取出大部分真菌毒素，但由于伏马毒素和赭曲霉类毒素化学结构中含有羧基[23]，水溶性强，对酸敏感，提取溶剂的酸度会影响提取效果，因此提取溶剂采用加入甲酸或水的方式来提高其稳定性及提取效率。在此基础上，本研究首先比较了乙腈-水-甲酸、乙腈-甲酸溶液体系的提取效果。由图3可知，由于玉米秸秆中含有较多纤维，吸水性较强，提取溶剂中加入水会增加样品提取难度，当使用乙腈∶水∶甲酸=80∶18∶2和乙腈∶水∶甲酸=90∶9∶1作为提取溶剂时，分别有11种和19种真菌毒素回收率不足60%，各组分在乙腈-甲酸溶液体系中的回收率较高，因此选择乙腈-甲酸作为提取溶剂。图3提取溶剂中水的使用对真菌毒素回收率的影响（n=3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F3a1（a）ESI+下12种真菌毒素的加标回收率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F3a2（b）ESI-模式下8种真菌毒素的加标回收率2.2.2提取溶剂中甲酸含量对真菌毒素回收率的影响（见图4）由图4可知，当使用乙腈∶甲酸=99∶1作为提取溶剂时，有15种真菌毒素回收率在60%~120%范围内，但AFB2、DON回收率不足60%，且FB1、FB2、FB3回收率分别为34%、25%、24%，因此对此提取溶剂不予考虑；随着甲酸含量的增加，当提取溶剂为乙腈∶甲酸=95∶5时，能够使20种真菌毒素的回收率均位于理想回收率范围内，且FB1、FB2、FB3的回收率分别提高至89%、68%、78%；当乙腈∶甲酸=90∶10作为提取溶剂时，T-2、HT-2等9种真菌毒素回收率均低于60%，除此之外，FB2、FB3在乙腈∶甲酸=90∶10溶液中的回收率较在乙腈∶甲酸=95∶5溶液中的回收率分别提高至97%和86%。王少敏等[24]使用超高效液相色谱串联质谱法检测中药瓜蒌皮中22种真菌毒素时发现，当提取溶剂为1%的甲酸乙腈时伏马毒素回收率低于10%；5%的甲酸乙腈溶液能够使伏马毒素回收率增加到40%~70%；当10%的甲酸乙腈做提取溶剂时，伏马毒素回收率能达到80%以上；说明提取溶剂中加入适当比例的甲酸能增加伏马毒素的提取效率，与本研究结果一致。但在本研究中需同时考虑20种真菌毒素的提取效果，因此综合考虑选择乙腈∶甲酸=95∶5作为提取溶剂。图4提取溶剂中甲酸含量对真菌毒素回收率的影响（n=3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F4a1（a）ESI+下12种真菌毒素的加标回收率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F4a2（b）ESI-模式下8种真菌毒素的加标回收率2.3净化剂种类的选择及用量优化结果（见图5）在真菌毒素检测过程中，需将杂质充分去除，减少样品提取液对目标物的干扰，从而让检测结果更加准确，同时避免仪器发生污染，灵敏度下降。玉米秸秆基质中存在大量的干扰物如淀粉、蛋白质、色素等，因此样品前处理时有必要对净化方法进行选择和优化。超高效液相色谱-串联质谱法检测真菌毒素常用的净化填料有MgSO4、PSA、C18和石墨化碳（GCB）[25]。MgSO4的作用是吸收基质中的水分促进有机相和水相的分离；PSA主要作用是去除极性较大的有机酸、糖类等杂质，但若使用过量会吸附酸性化合物从而影响检测结果的准确性；GCB的作用是吸附色素；C18具有疏水作用，对基质中的非极性组分有吸附效果，能去除脂肪酸等干扰物[26]。本研究分别比较了PSA、C18和GCB的净化效果，结果表明净化剂在吸附基质中杂质的同时也会不同程度地吸附目标化合物，PSA、C18对各真菌毒素的吸附较少，而GCB对真菌毒素的吸附较强，GCB在吸附基质中色素的同时也会吸附平面分子结构的真菌毒素[27]，造成大部分真菌毒素回收率的显著下降。因此选择MgSO4、PSA和C18作为净化剂，并对MgSO4、PSA、C18的用量配比进行正交试验验证，最终确定净化剂最优用量为100 mg MgSO4、100 mg PSA、150 mg C18[25,28]，对样品提取液净化前后的真菌毒素回收率进行比较。由图5可知，加入净化剂后回收率在80%~120%的真菌毒素数量明显增加，如3-Ac-DON、OTA、OTB等。以AFB2、3-Ac-DON和OTB为例，未净化时回收率仅为50%、58%、34%，加入净化剂后回收率分别提高至86%、100%、90%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.F005图5净化剂的使用对20种真菌毒素回收率的影响（n=3）2.420种真菌毒素的基质效应评价结果（见表4）基质效应（ME）主要是基质中的非挥发性组分与待测物质在表面离子化的过程中相互竞争产生的，会影响真菌毒素检测结果的准确性。本研究通过比较纯溶剂标准曲线和空白基质标准曲线的斜率对基质效应的强弱进行判断，依据1.3.2方法制备空白基质标准曲线，计算公式为ME=(1-A/B）×100%，其中A是玉米秸秆空白基质线性方程的斜率，B是溶剂空白线性方程的斜率。当ME20%为弱基质效应，在20%~50%之间为中等基质效应，ME50%为强基质效应[29]。由表4可知，10种真菌毒素表现为强基质效应，7种真菌毒素表现为中等基质效应，3种真菌毒素表现为弱基质效应。为降低基质效应的影响，本研究采用玉米秸秆空白基质校正曲线进行定量，保证分析结果的稳定性和准确性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.T004表420种真菌毒素的基质效应评价结果真菌毒素ME/%强度真菌毒素ME/%强度AFB118弱T-254强AFB230中HT-268强AFG146中ZEN15弱AFG268强α-ZEL60强3-Ac-DON35中β-ZEL57强15-Ac-DON31中ZAN14弱DON62强α-ZAL43中FB190强β-ZAL29中FB277强OTA45中FB3104强OTB55强2.5方法学验证2.5.120种真菌毒素的线性范围、线性方程、检出限及定量限（见表5）配制不同质量浓度的真菌毒素混合标准溶液时，采用1.3.2节制备的玉米秸秆空白基质溶液作为溶剂。以目标真菌毒素质谱峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg/L）为横坐标，绘制标准定量曲线；以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）目标化合物的定量离子峰面积对应的质量浓度分别确定20种真菌毒素的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。由表5可知，该检测方法所涉及的标准曲线（20种真菌毒素）具有较好的线性关系（R20.99），LOD为0.15~3.10 μg/kg，LOQ为0.49~10.33 μg/kg，均能满足实验室分析玉米秸秆中真菌毒素含量的要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.T005表520种真菌毒素的线性范围、线性方程、检出限及定量限真菌毒素线性范围/(μg/L)线性方程R2LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)AFB11~50Y=3.34×104X-8.95×1040.998 60.642.13AFB20.25~7.50Y=9.12×104X-2.42×1050.999 10.150.49AFG11~50Y=3.64×104X-2.07×1050.998 80.642.13AFG20.25~7.50Y=1.03×104X+2.97×1030.995 60.150.493-Ac-DON10~500Y=9.10×103X-4.85×1050.999 41.545.1315-Ac-DON10~500Y=5.83×103X+3.12×1040.995 83.1010.33DON10~500Y=4.79×103X+1.01×1050.998 41.143.80FB14~200Y=2.44×104X+9.20×1040.998 60.411.37FB24~200Y=4.40×104X-2.67×1050.999 42.086.93FB34~200Y=4.03×104X-5.75×1050.999 41.173.90T-24~200Y=1.15×104X-1.01×1050.993 00.571.90HT-210~500Y=2.00×104X-8.10×1050.991 50.541.80ZEN4~200Y=2.80×104X+1.90×1050.991 20.692.30α-ZEL4~200Y=1.22×104X+8.12×1030.999 41.244.13β-ZEL4~200Y=1.54×104X+1.57×1040.999 40.494.90ZAN4~200Y=8.63×104X-1.19×1050.999 61.123.73α-ZAL4~200Y=5.80×104X+1.00×1040.999 20.632.10β-ZAL4~200Y=6.72×104X+3.23×1040.998 70.873.90OTA4~200Y=6.40×104X-1.03×1040.999 21.364.53OTB8~400Y=3.23×104X-1.33×1050.999 21.504.992.5.220种真菌毒素的3水平加标回收率及相对标准偏差（见表6）试验对玉米秸秆的空白样品设置不同的添加水平（0.5~200 μg/kg），进行加标回收率试验，每个水平重复6次（n=6），并使用空白基质校正曲线进行定量，计算6次加标试验的平均回收率以及相对标准偏差。由表6可知，20种真菌毒素平均回收率为70.4%~118.3%，相对标准偏差RSD为1%~10%，本方法的灵敏度和重复性高，满足GB/T 27404—2008中对实验室食品理化检测质量的要求[30]，可用于玉米秸秆样品真菌毒素的日常定量分析工作。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.022.T006表620种真菌毒素的3水平加标回收率及相对标准偏差（n=6）真菌毒素加标浓度/(μg/kg)平均回收率/%RSD/%真菌毒素加标浓度/(μg/kg)平均回收率/%RSD/%AFB1291.36T-28107.1102073.4320106.774094.234084.73AFB20.5106.08HT-220100.14577.6310077.631072.8820081.69AFG12105.05ZEN4116.532078.822084.754089.2540100.46AFG20.5108.08α-ZEL4107.86589.482098.871098.554094.533-Ac-DON20113.63β-ZEL487.0410097.622089.8420074.954096.6715-Ac-DON2083.95ZAN4100.3110086.592092.4820095.694096.56DON20101.99α-ZAL4107.4710075.4102079.9620096.374093.03FB1897.95β-ZAL498.522070.422085.744070.854099.85FB28117.44OTA477.722081.182070.994072.9740108.62FB38118.33OTB894.5520112.854097.394073.568094.942.6玉米秸秆实际样品的测定结果分析采用所建立的方法对28份玉米秸秆样品进行检测，依据我国饲料真菌毒素限量标准[31]（GB 13078—2017）对检测结果进行判定分析。玉米秸秆主要受到DON、FB1、FB2、FB3、ZEN的污染，GB 13078—2017规定饲料原料中DON和ZEN的限量标准分别为5 000 μg/kg和500 μg/kg，伏马毒素（B1+B2）限量标准为60 000 μg/kg。试验选取的28份样品中DON检出率为96%，含量为5.5~3 172.9 μg/kg；ZEN检出率为25%，含量为2.2~102.5 μg/kg；FB1和FB2检出率分别为25%和21%，含量范围分别为3.3~142.9 μg/kg和3.0~74.9 μg/kg，均未超过我国国家标准。因此，为确保饲料生产质量安全，对未加工饲料原料中真菌毒素污染物的监督检测十分重要。3结论本研究在QuEChERS方法的基础上对前处理过程进行优化分析，确定了净化剂种类和配比，结合高效液相色谱-串联质谱法，建立了玉米秸秆饲料中20种真菌毒素的快速精准检测方法。该方法在低、中、高3个加标浓度水平下的平均回收率为70.4%~118.3%，相对标准偏差RSD为1%~10%。应用该方法对28份玉米秸秆样品进行检测，发现DON检出率最高，污染较严重，应加强监测与防护。试验所用方法灵敏度高、分析速度快、实用性强，覆盖真菌毒素种类较多，成本更低。经验证，准确性和精密度满足方法学要求，且方法检出限和定量限低，能满足真菌毒素日常风险监测的需求，也可为其他基质中多种真菌毒素含量的同时测定提供参考。