紫穗槐（Amorpha fruticosa L．）是豆科（Leguminosae）紫穗槐属（Amorphous L.）多年生落叶灌木，目前在我国已经广泛种植。紫穗槐中富含多糖、黄酮、二苯乙烯苷、三萜、多酚等多种生物活性成分[1-3]，具有较好的药用价值。紫穗槐的枝叶也常被用作饲料，饲用价值较高。在饲料中添加紫穗槐叶可以提高肉鸡、家兔和仔猪的日增重[4-6]，提高肉羊的生产性能[7]。多糖具有抗肿瘤[8]、调节免疫[9]、抗病毒[10]、抗糖尿病[11]以及抗菌[12]等多种生理功能，并且毒副作用低，在食品、医药和动物生产等方面均具有广阔的应用前景。目前对紫穗槐多糖的研究较少，通过文献检索未发现有关紫穗槐叶多糖作为饲料添加剂应用于动物生产中的报道。紫穗槐叶多糖有望作为一种新型饲料添加剂进行开发。植物中多糖的提取方法主要有水提法、酶解法、超声辅助法、微波辅助法、超高压法等[13]。本研究采用超声波辅助酶解法提取紫穗槐叶多糖，在单因素条件优化的基础上，应用响应面法进一步优化紫穗槐叶多糖的提取工艺，以期获得提取率较高的方法，并对所提多糖的抗氧化活性进行了研究，为紫穗槐的工业化生产及其在饲料中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂紫穗槐叶于2021年购自河南省民权县紫穗槐种植基地。纤维素酶、DPPH、BHT、β-胡萝卜素、亚油酸购自上海麦克林生化科技有限公司。无水葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇等均为分析纯，试验用水为双蒸水。1.2仪器与设备KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、AL204天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、YP10002电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）、Lambda35UV/Vis分光光度计（德国Perkin Elmer公司）。1.3测定指标及方法1.3.1紫穗槐叶多糖的提取及测定紫穗槐叶干燥至恒重，粉碎，准确称取紫穗槐叶粉末2.0 g置于锥形瓶中，以液料比20 mL/g加入蒸馏水。锥形瓶置于超声波清洗器中，设定超声功率300 W[14-15]，通过改变纤维素酶浓度、反应温度和酶作用时间进行提取，离心获取上清液。紫穗槐叶多糖中的多糖含量采用苯酚-硫酸法测定。精密称取葡萄糖10.00 mg，加入蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，即得0.1 g/L的标准溶液。精密吸取标准溶液0、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞试管中，补加蒸馏水至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1 mL，浓硫酸5 mL，摇匀后冷却，使用紫外分光光度计测定吸光度，测定波长为490 nm，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。紫穗槐叶多糖提取液稀释到合适体积，取0.2 mL按上述方法测定其吸光度，通过标准曲线计算多糖得率。多糖提取率=多糖质量/紫穗槐叶质量×100%(1)1.3.2超声辅助酶解法提取紫穗槐叶多糖单因素试验通过改变纤维素酶浓度（1%、2%、3%、4%、5%）、酶作用时间（1、2、3、4、5 h）和反应温度（40、45、50、55、60 ℃）进行单因素优化试验，考察各因素对紫穗槐叶多糖提取率的影响，每组单因素试验平行做3次。1.3.3响应面试验优化紫穗槐叶多糖提取工艺根据BBD试验设计原理和单因素试验的结果，以紫穗槐叶多糖得率为考察指标，选择纤维素酶浓度（A）、酶作用时间（B）、反应温度（C）为考察因素对紫穗槐叶多糖提取工艺进行响应面分析，响应面试验因素与水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.T001表1响应面因素与水平设计水平A纤维素酶浓度/%B酶作用时间/hC反应温度/℃-1314504250153551.3.4抗氧化试验1.3.4.1DPPH自由基清除能力参考文献[16]，用甲醇制备0.08 g/L DPPH溶液，避光保存。将2 mL不同浓度的紫穗槐叶多糖溶液和1 mL DPPH溶液混合。混合物在室温下避光孵育30 min，在波长517 nm处测量DPPH清除能力。丁基化羟基甲苯（BHT）用作阳性对照（含有除多糖以外的所有试剂的溶液）。计算紫穗槐叶多糖对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率=(1-OD样品/OD对照)×100%(2)1.3.4.2β-胡萝卜素漂白试验参考文献[17]，将1 mg β-胡萝卜素溶于10 mL氯仿中，加入40 μL亚油酸和400 μL吐温40。50 ℃旋转蒸发氯仿，加入200 mL蒸馏水得到β-胡萝卜素-亚油酸体系。0.2 mL的2 g/L紫穗槐多糖加入5 mL β-胡萝卜素-亚油酸体系中，50 ℃孵育3 h。在490 nm处每20 min测量一次吸光度。以BHT为阳性对照，空白为阴性对照。计算β-胡萝卜素漂白的抑制率。抑制率=(1-R样品/R对照)×100%(3)R=ln(a/b)×(1/t)(4)式中：a为初始时间的吸光度；b为反应20、40、60、80、100、120、140、160、180 min后的吸光度；R为反应速率；t为反应时间。1.3.4.3羟基自由基清除能力紫穗槐叶多糖对羟基自由基的清除能力采用Fenton法测定[18]。将1 mL不同浓度的紫穗槐多糖溶液和1 mL 1.5 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L H2O2以及1 mL 20 mmol/L水杨酸混合。将混合物在37 ℃孵育30 min，在510 nm处测量吸光度。维生素C（VC）用作阳性对照。计算样品抑制羟基活性的能力。羟基自由基清除率=(1-OD样品/OD对照)×100%(5)2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1纤维素酶浓度对紫穗槐叶多糖得率的影响（见图1）由图1可知，在纤维素酶浓度较低时，紫穗槐叶多糖的得率较低。当纤维素酶浓度从1%增加到4%时，多糖的得率升高；纤维素酶浓度从4%增加到5%时，多糖的得率反而略有降低，分析可能是酶浓度的增加抑制了酶活性，造成紫穗槐叶多糖的得率降低。因此紫穗槐叶多糖提取的最佳纤维素酶浓度为4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F001图1纤维素酶浓度对多糖得率的影响2.1.2酶作用时间对紫穗槐叶多糖得率的影响（见图2）由图2可知，酶作用时间为1~2 h，紫穗槐叶多糖的得率升高并在2 h时达到最大；作用时间继续增加，多糖得率降低，原因可能是酶解反应在2 h时已基本完成，延长反应时间会导致超声波破坏多糖的结构，使多糖的得率下降。因此确定提取紫穗槐叶多糖的最佳酶作用时间为2 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F002图2酶作用时间对多糖得率的影响2.1.3反应温度对紫穗槐叶多糖得率的影响（见图3）由图3可知，随着反应温度由40 ℃升高到50 ℃时，紫穗槐叶多糖的得率也一直增加，并在50 ℃时达到最大，这可能是因为温度的增加使酶的活性升高且使组织内分子运动加快，多糖溶出增加；而温度的继续上升导致得率下降可能是由于高温降低了酶活性。因此，紫穗槐叶多糖的最佳提取温度为50 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F003图3反应温度对多糖得率的影响2.2响应面试验2.2.1响应面试验设计方案及结果分析（见表2、表3）在单因素试验基础上，根据BBD试验设计原理，选择纤维素酶浓度、酶作用时间和反应温度进行三因素三水平的响应面分析，对紫穗槐叶多糖的提取工艺进行优化，以确定紫穗槐叶多糖的最佳提取条件。利用Design-expert 8.0软件对试验数据进行分析，得到回归方程：Y=7.91+A+0.20B+0.35C+0.17AB-0.24AC-0.098BC-0.54A2-1.30B2-0.69C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.T002表2Box-Behnken试验及结果试验号A/%B/hC/℃多糖得率/%152557.67232556.33331504.95442508.04542507.89652457.51741556.19842507.94932455.201043556.391141455.251233505.021342507.871443455.841542507.811651507.781753507.52由表3可知，在本试验中，该模型P0.000 1，F值为176.28，表明回归方程极显著；而失拟项P0.05，失拟项F值为2.81，说明该模型方程拟合较好，可用于预测紫穗槐叶多糖的得率并用于确定紫穗槐叶多糖的最佳提取工艺。本模型的R2值为0.995 6，而修正相关系数RAdj2值为0.990 0，使用该模型能够解释99%响应值的变化。此外，模型的变异系数较低为1.71%，表明试验值的精确性和可靠性。结果显示，A、B、C、AB、AC、A2、B2和C2对考察指标紫穗槐叶多糖得率影响显著，而BC对考察指标紫穗槐叶多糖得率影响不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.T003表3回归方程方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型21.00092.330176.280.000 1A7.96017.960601.410.000 1B0.32010.32024.180.001 7C0.97010.97072.990.000 1AB0.11010.1108.480.022 6AC0.24010.24017.770.004 0BC0.03810.0382.870.133 9A21.23011.23093.190.000 1B27.13017.130538.650.000 1C22.01012.010152.010.000 1残差0.09370.013失拟项0.06330.0212.810.171 7净误差0.03047.45×10-3总离差21.09016注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.2.2各因素交互作用对紫穗槐叶多糖得率的影响（见图4）由图4（a）可知，随着酶浓度的增加和酶作用时间的延长，紫穗槐叶多糖得率也呈先增加后降低的趋势。酶浓度和酶作用时间存在显著的交互作用。由图4（b）可知，随着酶浓度增加和反应温度升高，紫穗槐叶多糖得率先升高后降低，酶浓度和反应温度存在显著的交互作用。由图4（c）可知，酶作用时间延长有助于多糖的提取，但提取时间过长可能会引起多糖的降解；反应温度过低不利于反应的进行，过高则会造成酶活性降低。反应温度与酶作用时间存在一定的交互作用。图4各因素交互作用对紫穗槐叶多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F4a1（a）酶浓度与酶作用时间对多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F4a2（b）酶浓度与反应温度对多糖得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F4a3（c）酶作用时间与反应温度对多糖得率的影响2.2.3最佳提取工艺的确定与验证通过Design-expert 8.0软件进行的响应面分析显示，紫穗槐叶多糖最佳提取工艺参数为纤维素酶浓度4.92%、反应温度50.4 ℃、酶作用时间2.13 h。此条件下预测提取率为8.40%。为验证模型方程的可靠性并考虑实际操作，将提取条件调整为纤维素酶浓度5%、反应温度50 ℃、酶作用时间2 h。在此条件下进行验证性试验并重复提取3次，3次所得结果分别为8.03%、8.32%、8.57%，平均值为8.31%，与响应面模型的预测结果接近，证明该模型准确可靠，所得紫穗槐叶多糖提取条件可行，具有实用价值。2.3抗氧化试验2.3.1DPPH自由基清除能力（见图5）由图5可知，当紫穗槐叶多糖水平在0.062 5~2.000 0 g/L时，对DPPH自由基的清除率呈上升趋势，用Graphpad计算得到其半数抑制浓度IC50值为0.07 g/L。当紫穗槐叶多糖浓度为0.50 g/L时，对DPPH自由基清除率为83.79%，BHT对DPPH自由基清除率最高为93.69%。结果表明，紫穗槐叶多糖具有较强的DPPH自由基清除作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F005图5紫穗槐叶多糖对DPPH自由基清除能力2.3.2β-胡萝卜素-亚油酸体系抗氧化作用（见图6）由图6可知，紫穗槐叶多糖和BHT均具有很强的亚油酸氧化抑制能力，紫穗槐叶多糖对β-胡萝卜素漂白的抑制能力最高可达到BHT的83%。结果表明，紫穗槐叶多糖能够较好地抑制脂质过氧化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F006图6紫穗槐叶多糖β-胡萝卜素漂白试验抗氧化活性2.3.3紫穗槐叶多糖对羟基自由基清除能力（见图7）由图7可知，紫穗槐叶多糖对羟基自由基的清除率随着浓度的上升而增强，浓度为1.0 g/L时，对羟基自由基的清除率达99.18%，与VC相近。结果表明，紫穗槐叶多糖对羟基自由基也有较强的清除作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.014.F007图7紫穗槐叶多糖对羟基自由基清除能力3讨论酶解法提取多糖具有反应条件温和、回收率高且提取的多糖品质高等优点。本试验为进一步提高多糖的提取率，在采用酶解法提取多糖的同时，还采用了超声辅助。超声辅助提取法主要利用超声波的机械效应和空化作用使材料的细胞壁和细胞膜等生物组织破碎，并加大细胞内的传质效率，从而促进多糖成分的溶出[19]。超声辅助酶解法具有提取效率高、提取时间短、操作简单等优点。氧化应激会造成动物生产和生殖性能下降[20]，植物多糖作为一种新型的绿色饲料添加剂，具有改善动物生长性能、维持动物体内氧化还原系统平衡、调节免疫增加抗病性等作用[21-22]，具有广阔的应用前景。紫穗槐在我国东北、华北、西北及西南等地区广泛种植[23]，材料易得，价格低廉。且紫穗槐叶多糖具有较好的抗氧化活性，对DPPH自由基和羟基自由基均具有较强的清除作用，并具有良好的抗脂质过氧化活性。紫穗槐叶多糖有望开发为一种新的饲料添加剂应用于改善畜禽抗氧化能力。4结论经过单因素及响应面试验获得了超声辅助酶解法提取紫穗槐叶多糖的最佳工艺，即酶浓度5%、反应温度50 ℃、酶作用时间2 h，此时紫穗槐叶多糖得率可达8.31%，与预测值8.40%基本相符，表明该工艺稳定可行。本研究中的提取工艺简单、提取率高、便于推广，提取的紫穗槐叶多糖具有很好的抗氧化活性，具有较高的开发利用价值。