红甜菜（Beta vulgaris L.）为藜科（Chenopodiaceae）甜菜属（Genus Beta）植物[1]，是欧美国家主要的蔬菜来源之一，后被我国引入进行大面积种植[2]。研究发现，红甜菜水提物可以有效促进失血性贫血的恢复[3]，抑制肿瘤细胞的生长[4]，具有抗氧化功能[1]。红甜菜水提物中含有的红甜菜色素是一种安全、无毒的天然食用色素，在降血糖[5]、降血脂[6]等方面展现出优良性能[7-8]。红甜菜块根中含有丰富的多糖。现代研究表明，植物多糖在修复受损屏障、保持微生态平衡、降血糖等方面具有良好的效果[9]。研究发现，红甜菜苷多糖可以提高小鼠免疫器官的重量，提高小鼠单核巨噬细胞碳清除能力，提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力，表明红甜菜多糖具有显著的免疫增强作用[10]。因此，红甜菜多糖可被开发成营养添加剂或天然药物添加到动物饲料中。目前，国内对红甜菜的研究主要集中在红甜菜色素的研究和开发，而关于红甜菜多糖的研究相对较少。水提醇沉法[11]和超声波辅助水提法[12]是提取植物多糖的两种常用方法。本研究采用两种方法对红甜菜多糖进行提取优化试验，得出红甜菜中多糖提取的最优工艺条件；采用Sevag法、活性炭法及石油醚法对提取得到的粗多糖进行除蛋白、脱色及除脂肪等试验，为红甜菜多糖的进一步研究提供相应参考。1材料与方法1.1材料与试剂红甜菜块根由青海省西宁市千紫缘农业科技博览园提供。无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。1.2试验方法1.2.1样品预处理新鲜红甜菜块根去皮，烘干，粉碎，过80目筛，装入自封袋。1.2.2水提醇沉法提取红甜菜多糖1.2.2.1单因素试验固定时间1.5 h，提取温度80 ℃，探究液料比（70、80、90、100 mL/g）对红甜菜多糖得率的影响。固定液料比90 mL/g，提取时间1.5 h，探究提取温度（60、70、80、90 ℃）对红甜菜多糖得率的影响。固定液料比90 mL/g，提取温度80 ℃，探究提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0 h）对红甜菜多糖得率的影响。1.2.2.2正交试验基于单因素试验结果，以相关因素为自变量，多糖提取率为评价标准，采用三因素三水平的正交试验优化红甜菜多糖的提取工艺参数。正交试验因素和水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T001表1正交试验因素和水平设计水平A液料比/(mL/g)B提取温度/℃C提取时间/h180701.0290801.53100902.01.2.3超声波辅助水提法提取红甜菜多糖1.2.3.1单因素试验固定时间30 min，提取温度40 ℃，探究液料比（20、30、40、50、60 mL/g）对红甜菜多糖得率的影响。固定液料比40 mL/g，提取时间30 min，探究提取温度（20、30、40、50、60 ℃）对红甜菜多糖得率的影响。固定液料比40 mL/g，提取温度40 ℃，探究提取时间（10、20、30、40、50 min）对红甜菜多糖得率的影响。1.2.3.2正交试验基于单因素试验结果，以相关因素为自变量，多糖提取率为评价标准，进行三因素三水平的正交试验，得出最优提取条件。正交试验因素和水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T002表2正交试验因素和水平设计水平A液料比/(mL/g)B提取温度/℃C提取时间/h1303020240403035050401.2.4红甜菜多糖提取率的测定1.2.4.1标准曲线的绘制准确吸取质量浓度为1.00 g/L的葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于7个100 mL容量瓶中定容，再分别吸取这7种溶液2.0 mL于25 mL比色管中，以蒸馏水作参比，依次加入新配制质量分数为5%的苯酚溶液1.0 mL，混匀，加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，静置5 min，在沸水浴中加热15 min，冷却至室温。在490 nm处测定吸光度[13]，并以葡萄糖质量浓度（g/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程y=11 089.357x+17.819（R2=0.995）。1.2.4.2红甜菜多糖提取率计算准确吸取2.0 mL红甜菜多糖溶液定容至50 mL，吸取定容后的溶液2.0 mL，于490 nm处测定吸光度，计算红甜菜多糖提取率[14]。多糖提取率=(c×V×D)/W (1)式中：c为样品中多糖的质量浓度（g/L）；V为定容体积（mL）；D为样品稀释倍数；W为红甜菜粉末质量（mg）。1.2.5红甜菜多糖的纯化1.2.5.1蛋白质的脱离Sevag试剂与多糖提取液按体积比为5∶1加入15%的红甜菜多糖溶液混合，经水浴振荡20 min，取出后静置30 min，离心，收集上清液，如此反复沉淀以除去蛋白质杂质。1.2.5.2色素的去除在上述去除蛋白质杂质的红甜菜多糖溶液中加入一定比例的活性炭，用保鲜膜封口，充分摇匀，40 ℃水浴1.5 h，抽滤除去活性炭，旋蒸浓缩，烘干，得到脱色的红甜菜多糖粉末。1.2.5.3脂肪的去除将去除蛋白质和色素的红甜菜多糖粉末放入索氏提取器内，添加石油醚后，75 ℃恒温水浴锅中浸提12 h，取出干燥，即得除去脂肪的红甜菜多糖样品。2结果与分析2.1水提醇沉法单因素试验结果2.1.1液料比对红甜菜多糖提取率的影响（见图1）由图1可知，当液料比从70 mL/g增至100 mL/g时，红甜菜多糖提取率呈先升高后下降的趋势，当液料比为90 mL/g时，红甜菜多糖提取率达到最高，为3.12%。由此推测适当增加料液比，有利于多糖溶出，而溶剂添加量过高时，由于多糖有限的溶出度，随着料液比的增大多糖含量不会继续增加[15]。因此，本试验中提取红甜菜多糖最佳液料比为90 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.F001图1液料比对红甜菜多糖提取率的影响2.1.2提取温度对红甜菜多糖提取率的影响（见图2）由图2可知，随温度升高多糖提取率呈增加趋势，当温度超过80 ℃，红甜菜多糖提取率逐渐降低。这可能是温度适当升高加速了分子间的运动，引起多糖溶出率上升[16]，但温度过高又破坏了多糖的分子结构，使得多糖变性，从而影响提取率。因此，红甜菜多糖的最佳提取温度确定为80 ℃，与白海娜等[17]提取双孢菇多糖研究结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.F002图2提取温度对红甜菜多糖提取率的影响2.1.3提取时间对红甜菜多糖提取率的影响（见图3）由图3可知，提取时间为0.5~1.5 h时，随提取时间的延长，红甜菜多糖提取率呈上升趋势；而当提取时间大于1.5 h时，红甜菜多糖提取率反而下降，表明超过适宜的提取时间可能增大了溶液体系的黏度，抑制多糖溶解[18]。因此，1.5 h为最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.F003图3提取时间对红甜菜多糖提取率的影响2.2水提醇沉法正交试验结果（见表3、表4）由表3可知，根据极差值可判断出，在水提醇沉法中，红甜菜多糖提取率影响因素主次为提取时间（C）液料比（A）提取温度（B），最佳提取水平组合为A2B1C2，即液料比为90 mL/g、提取温度为70 ℃、提取时间为1.5 h。在此组合下，红甜菜多糖提取率为2.33%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T003表3水提醇沉法正交试验结果项目ABC多糖提取率/%11111.9521222.1531331.8042122.3352232.1662312.1573132.1583211.8193322.30K15.906.435.91K26.646.126.78K36.266.256.11k11.972.141.97k22.212.042.26k32.092.082.04R0.240.100.29由于单因素试验仅考虑单个变量对多糖提取效果的影响，为正交试验提供合适的选择范围，在正交试验中可能受液料比、时间和温度3种因素共同影响，因此得到的多糖提取率均低于单因素试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值误差0.05420.027A0.09120.0461.7020.370B0.01620.0080.3010.768C0.13820.0692.5810.2792.3超声辅助浸提法单因素试验结果2.3.1液料比对红甜菜多糖提取率的影响（见图4）由图4可知，多糖添加量与溶剂比例为40 mL/g时，红甜菜多糖提取率达到最大，为2.88%。原因是在较少溶剂中，超声的空化作用产生机械力使植物细胞裂解，使胞内产物迅速析出；当溶剂用量较大时红甜菜多糖与溶剂体系的接触面积不断增大，溶解出其他杂质，多糖溶出受到抑制，多糖溶出量降低[19]。因此，液料比40 mL/g为提取红甜菜多糖的最佳条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.F004图4液料比对红甜菜多糖提取率的影响2.3.2提取温度对红甜菜多糖提取率的影响（见图5）由图5可知，提取温度达到40 ℃时，红甜菜多糖提取率最大，表明在超声波的振动与适宜的温度条件下加速了多糖物质的释放，而高于这一温度时，多糖得率逐渐降低。原因可能是超声温度过高破坏了多糖的结构，造成多糖降解[20]。因此40 ℃为提取红甜菜多糖的最佳条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.F005图5提取温度对红甜菜多糖提取率的影响2.3.3提取时间对红甜菜多糖提取率的影响（见图6）由图6可知，在提取时间为10~30 min时，红甜菜多糖提取率从3.41%增加至5.56%，在30 min时间内，延长超声时间，多糖充分溶解。提取时间超过30 min后，提取率缓慢下降，是因为当提取时间超出适宜范围，超声波导致多糖发生降解[21-22]。因此，30 min为最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.F006图6提取时间对多糖提取率的影响2.4超声辅助浸提法正交试验结果（见表5、表6）由表5中极差值可知，各因素对枸杞多糖提取率影响大小顺序为液料比提取时间提取温度，确定A2B2C2为最佳提取水平，即液料比40 mL/g、提取温度40 ℃、提取时间30 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T005表5超声辅助浸提法正交试验结果项目ABC多糖提取率%11114.6221225.0931334.2442125.2952235.1362315.1173134.0483213.9293324.09K113.9513.9513.65K215.5414.1414.47K312.0513.4413.41k14.654.654.55k25.184.714.82k34.024.484.47R1.160.230.35与正交试验中红甜菜多糖提取率最高的组合A2B1C2进行对比验证，组合A2B2C2多糖提取率为6.85%，证明A2B2C2为最优组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T006表6方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值A2.02421.01219.4580.049B0.08720.0440.8400.544C0.20620.1031.9800.336误差0.10420.0522.5纯化试验结果（见表7）纯化试验旨在除去红甜菜多糖粉末中的蛋白质、色素和脂肪。由表7可知，利用Sevag试剂去除红甜菜多糖粉末中的蛋白质，去除率为29.73%；利用活性炭去除红甜菜多糖粉末中的色素，去除率为3.88%；利用石油醚去除红甜菜多糖粉末中的脂肪，去除率为2.76%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.013.T007表7纯化试验结果项目蛋白质色素脂肪去除率29.733.882.76%3结论本试验得出采用超声辅助法提取红甜菜多糖的效果优于水提醇沉法。超声辅助法提取红甜菜多糖时提取率最佳的液料比为40 mL/g，提取率最高温度为40 ℃，提取最佳时间为30 min；最主要的影响因素为液料比（A），提取温度（B）影响最小。对超声辅助法得到的粗多糖经Sevag试剂、活性炭和石油醚纯化处理，脱蛋白率、除色素率和除脂肪率分别为29.73%、3.88%、2.76%。试验仅选取了单一的超声频率，并未对最佳的一个超声频率进行探索；纯化试验均未探究蛋白质、色素和脂肪的最佳去除方法及去除条件，因此后期可进一步对红甜菜多糖提取的最佳纯化工艺进行探索。