奶牛乳腺炎作为奶牛三大疾病之一，是一种影响奶牛生产的常见疾病，严重制约奶牛产业的发展。乳腺炎通常是由病原微生物入侵导致，直接影响泌乳能力和乳汁质量。乳腺炎一般由细菌感染引起，主要致病菌为大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）[1]。根据细菌病原体的不同，乳腺炎分为传染性乳腺炎和环境性乳腺炎。临床上，牛乳腺炎通常由大肠杆菌引起，造成重大的生产损失和动物福利问题，并可能导致动物死亡[2]。抗生素是治疗乳腺炎的主要方法，但抗生素不规范使用可导致病原菌产生耐药性，出现抗生素残留问题[3-4]。在此背景下，为避免细菌耐药性不断产生的现状进一步恶化，开发更多元化的针对奶牛乳腺炎的治疗方式迫在眉睫。植物成分具有低毒、低残留、不易产生耐药性的优点，因此开展了许多关于植物成分替代抗生素的研究。其中，中草药具有抗炎、调节内环境、提高免疫力等作用。本课题组以中医传统理论为基础，结合临床经验，开发出以蒲公英、紫花地丁、王不留行为君药；当归、瓜蒌、路路通为臣药；白术、白芍、柴胡为佐药；甘草为使药所配伍而成的中草药方剂，且通过试验证明中草药提取物具有良好的抗炎效果[5]。基于此，本试验以小鼠为试验动物，探讨中草药提取物对LPS诱导的小鼠乳腺炎的调节作用。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物本试验用雌性怀孕昆明鼠，体重（35±2） g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。所有小鼠自由饮食和摄食，12 h明暗交替。1.1.2试验试剂中草药方剂中各味中草药均购自石河子市子午路大药房；脂多糖（055：B5）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；4%多聚甲醛固定液购自上海吉至生化科技有限公司；苏木素伊红（HE）染色液、水合氯醛购自上海源叶生物科技有限公司；地塞米松磷酸钠注射液购自辰欣药业股份有限公司；小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）以及髓过氧化物酶（MPO）ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。1.1.3试验仪器RE52CS-2型旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，精密电子天平购自北京赛多利斯公司，202型电热恒温干燥箱购自北京市永光明医疗仪器厂，1510型全波长酶标仪（序列号1510-02980C）购自Thermo Fisher公司，HVA-85高压蒸汽灭菌锅购自华粤行仪器有限公司，ZG-280中药煎药包装一体机购自吉首市中诚制药机械厂，CMP-HP-20L纯水仪购自成都优越科技有限公司，Corning-Ym-2028A显微镜购自日本OLYMPUS集团有限公司，体式显微镜（JSZ6）购自明兹精密仪器（上海）有限公司，SORVALL LEGEBD MICRO 21高速离心机购自美国TheomoFisher公司，10、50、100 μL移液枪购自德国Transferpette公司。1.2试验方法1.2.1中草药提取物制备中草药提取物的制备方法与本课题组前期制备方法相同[6]：将500 g配伍好的中草药方剂用5 L蒸馏水浸泡2~3 h，待药液颜色明显变化后使用自动煎药机煎煮，武火煮沸后文火继续煎煮1.5 h，待药液冷却至室温后盛出；在剩余药渣中再加入4 L蒸馏水，操作步骤同上。将两次药液合并，用旋转蒸发仪将其浓缩至2 g/mL。按比例配制高（1.6 g/mL）、中（0.8 g/mL）、低（0.4 g/mL）浓度的中草药提取物待用。1.2.2LPS诱导的小鼠乳腺炎模型的构建及评价取产后5~7 d昆明母鼠，于造模3 h前禁饲并将仔鼠与母鼠分笼。将4%水合氯醛按0.1 mL/g腹腔注射于产后母鼠；待小鼠麻醉后在体式显微镜下，将50 μL 0.2 g/L的LPS用微量进样器通过乳腺管开口注射于小鼠第4对乳腺中，注射完毕后轻揉乳腺使其在乳腺中均匀分布。注射LPS 24 h后处死小鼠，取乳腺组织进行组织病理学评价以及用ELISA法检测小鼠乳腺中TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO含量；通过临床观察发现小鼠乳腺变形肿胀充血或伴有坏死灶，HE染色观察到小鼠乳腺腺泡壁增厚，乳腺组织间质中有炎性浸润现象则可判断小鼠造模成功。1.2.3试验设计试验选取72只产后3~5 d SPF级昆明雌鼠，随机挑取12只为空白对照组（BC组），其余60只随机分为5组，即模型组（M组）、阳性对照组（Dex组）以及中草药提取物高（ZY-H组）、中（ZY-M组）、低（ZY-L组）剂量组，每组12只。除BC组外，其余各组小鼠对环境适应后进行乳腺炎造模，造模方法同1.2.2。造模结束2 h后，中草药提取物各剂量组按设计好的浓度灌胃给药（ZY-H组、ZY-M组、ZY-L组小鼠分别给药16、8、4 mg/g），Dex组小鼠腹腔注射5 mg/kg地塞米松磷酸钠注射液，BC组及M组灌胃等体积的生理盐水，造模后连续处理7 d。1.2.4测定指标及方法1.2.4.1样品采集试验第7 d药物处理完成2 h后，处死小鼠并采集乳腺组织，一部分置于4%多聚甲醛固定液，一部分于-80 ℃保存。1.2.4.2组织学观察随后按步骤进行小鼠乳腺组织HE染色切片制作，同时采用标准评估方法确定乳腺损伤程度。根据水肿、中性粒细胞浸润和出血对整个乳腺损伤进行评分；每个切片随机观察3个视野。损伤评分代表严重程度（0分，无损害；1分，轻度损害；2分，中度损害；3分，严重损害；4分，极严重损害）。1.2.4.3细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PPAR-γ、MPO含量检测细胞因子前称取0.1 g乳腺组织，按质量比（乳腺组织∶PBS=1∶9）匀浆，制备好的匀浆液3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用ELISA试剂盒检测小鼠乳腺中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PPAR-γ、MPO含量。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，单因素方差法进行组间比较，LSD法检验假定方差齐性，邓尼特T3法检验未假定方差齐性。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1LPS诱导的小鼠乳腺炎模型评价初步临床观察小鼠乳房，可见沿第4对乳头向四周辐射状的红晕出现，部分小鼠透过皮肤可见血丝；剪开小鼠皮肤观察乳腺组织，可见小鼠乳腺附着于表皮内侧且第四对乳腺肿大，并伴有充血、水肿等肉眼可见炎性现象。LPS对小鼠乳腺组织的影响见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F001图1LPS对小鼠乳腺组织的影响（200×）由图1可知，通过小鼠乳腺病理组织切片发现，BC组小鼠乳腺组织结构完整，腺泡壁厚度正常，腺泡上皮细胞排列紧密结构清晰，部分腺泡内还有分泌的乳汁，脂肪细胞结构及排列同样未见异常；M组小鼠乳腺组织结构遭到破坏，腺泡壁增厚，部分乳腺毛细血管壁变薄，血管腔内充满红细胞，乳腺腺泡腔、乳腺导管以及乳腺间质中可见大量炎性细胞，腺泡壁增厚且部分腺泡壁及乳腺导管结构遭到破坏。2.2中草药提取物对模型小鼠乳腺组织的影响及组织病理学评分（见图2、图3）由图2可知，BC组小鼠乳腺组织结构完整清晰腺泡壁及乳腺管上皮细胞排列紧密，未见病理现象；M组小鼠乳腺组织结构缺失，腺泡壁增厚，部分乳腺导管上皮细胞脱落，乳腺腺泡、乳腺导管以及乳腺间质内可见大量炎性细胞浸润，乳腺间质脂肪细胞明显减少；Dex组以及ZY剂量组中小鼠乳腺组织结构的破坏程度较M组有明显的恢复，乳腺腺泡、乳腺导管以及乳腺间质中的炎性细胞明显减少，乳腺间质中的脂肪细胞明显增多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F002图2各组小鼠乳腺HE染色（200×）由图3可知，与BC组比较，M组小鼠乳腺组织病理学评分极显著升高（P0.01）；与M组比较，Dex组及ZY各组小鼠乳腺组织病理学评分极显著降低（P0.01）。结果表明，ZY对LPS诱导的小鼠乳腺炎模型的乳腺组织有良好的保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F003图3各组小鼠乳腺组织病理学评分注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下图同。2.3中草药提取物对模型小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PPAR-γ、MPO含量的影响（见图4）由图4可知，与BC组相比，M组小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MPO含量均极显著提高（P0.01），PPAR-γ含量极显著降低（P0.01）；与M组相比，Dex组以及ZY各剂量组小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MPO含量均极显著降低（P0.01），PPAR-γ含量极显著升高（P0.01）；与Dex组相比，ZY-H组小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-8、MPO含量极显著升高（P0.01），PPAR-γ极显著降低（P0.01）。图4中草药提取物对小鼠乳腺中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PPAR-γ、MPO含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F4a1（a）TNF-α含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F4a2（b）IL-1β含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F4a3（c）IL-6含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F4a4（d）MPO含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F4a5（e）IL-8含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.015.F4a6（f）PPAR-γ含量3讨论乳腺炎是奶牛最常见的疾病之一，会导致奶牛的产奶量减少，奶质量下降，严重制约全球乳业的发展[6-7]。奶牛个体差异、环境因素以及致病微生物入侵是造成奶牛乳腺炎的主要原因[8]。乳腺炎是指由乳腺组织感染引起的炎症反应，主要特征是水肿和炎症细胞浸润[9]。包括革兰氏阴性病原体在内的多种微生物均可引起乳腺炎，如大肠杆菌等[10]。大肠杆菌是一种常见的病原体，通常定植在奶牛身上，大肠杆菌的细胞膜表面物质脂多糖（LPS）是引起乳腺炎的一个重要毒力因子[11]。研究表明，LPS可以通过激活TLR4来激活NF-κB途径，并促使TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-6等炎性细胞因子大量产生[9,12-13]。由于奶牛养殖成本高、妊娠期长等因素，在前期研究中直接使用奶牛作为模型动物存在一定困难。因此，国内外通常利用LPS构建的小鼠乳腺炎模型作为前期研究奶牛乳房炎治疗药物的试验模型[14]。有研究表明，通过乳腺管注射50 μL浓度为0.2 g/L的LPS 24 h，可在很大程度上还原乳腺炎的症状[15-16]。本试验在小鼠第4对乳头的乳腺管内注射LPS，成功构建了小鼠乳腺炎模型。临床观察发现，M组小鼠乳腺明显肿胀充血，并且可从乳腺管中挤出红色的带血乳汁；HE染色后可观察到，M组小鼠乳腺组织结构的完整性遭到严重破坏，乳腺上皮细胞大量脱落，乳腺组织中乳腺间质内可见大量炎性细胞。ELISA检测结果显示，M组小鼠乳腺组织中所测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MPO含量极显著高于BC组，与前人研究结果一致[17-18]。Guo等[19]发现，中草药提取物甘草查尔酮A可显著缓解LPS诱导的乳腺组织的损伤。由本试验中组织切片结果可知，ZY各剂量组对受破坏的乳腺组织恢复具有促进作用。目前，大量研究表明，炎症细胞因子在病原微生物入侵宿主中起到关键的防御作用[20]。研究表明，TNF-α和IL-1β在启动和发展参与乳腺炎过程中具有重要的作用[21]。IL-1β在感染的早期阶段产生，是一种关键的炎症介质[22]。TNF-α在炎症发生过程中可诱导IL-6等其他促炎症因子产生[23]。适当水平的促炎症细胞因子对抗病原体的免疫反应十分重要，但过多细胞因子产生可能导致严重的细胞损伤[24-25]。也有研究显示，大量炎症介质快速释放会打破乳腺免疫系统以外的平衡，招募大量的中性粒细胞，导致乳腺细胞功能受损和乳腺损伤[26-27]。炎症介质刺激乳腺管肿胀，可导致乳汁淤积，加重乳腺的炎症反应[28]。因此，有效抑制炎症细胞因子水平有利于缓解乳腺炎的症状。细菌感染导致促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8大量释放，这些细胞因子在炎症反应启动和调节过程中起到关键作用，同时还促进了中性粒细胞的募集以及MPO的含量及活性。Jiang等[9]研究发现，虎杖苷可显著降低乳腺炎小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量以及表达量，并通过抑制p38 MAPK/NFκB通路从而缓解小鼠乳腺炎的发展。Che等[21]发现，大蒜素可降低乳腺中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA表达量，但主要是通过抑制TLR4/NFκB信号通路发挥作用。本试验结果显示，ZY可降低模型小鼠乳腺中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量，但具体可能通过何种信号通路所发挥作用还有待进一步研究。Xin等[29]研究发现，薯蓣皂苷可以可减少乳腺组织中的炎症病变和中性粒细胞募集，还可减少IL-1β等促炎因子的产生，并抑制LPS诱导的小鼠乳腺炎中NLRP3炎症小体的活化。本试验中，ZY各剂量组小鼠模型乳腺组织的形态结构均得到改善，炎性细胞因子IL-1β的含量极显著降低，但本试验所用ZY是否可以抑制NLRP3炎症小体的活化还有待进一步研究。Lai等[30]表明，靛蓝素通过下调炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量，并通过NF-κB和MAPK信号通路介导的TLR4能够有效抑制LPS诱导的小鼠乳腺炎。本试验中，各剂量ZY均可减少乳腺炎小鼠模型中乳腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，与Lai等[30]试验结果一致。但由于未进行更深一步试验，ZY是否通过抑制NF-κB和MAPK信号通路从而减轻乳腺炎还有待研究，这也是本课题组下一步的工作目标。PPAR-γ是一种重要的核受体，调节炎症反应的PPAR-γ激动剂可抑制NF-κB的激活和炎性细胞因子的产生[31]。同时，PPAR-γ在乳腺组织中也有表达[32]。Yu等[33]检测了胡椒碱对LPS型乳腺炎小鼠模型乳腺中细胞因子PPAR-γ的影响，研究发现，胡椒碱处理组的乳腺组织中PPAR-γ水平显著增加，缓解了乳腺炎症的发展。本试验发现，与BC组相比，M组乳腺组织中PPAR-γ含量显著降低；而与M组相比，ZY各剂量组PPAR-γ含量显著提高，表明ZY有可能通过提高PPAR-γ含量来发挥对乳腺的保护作用。MPO是中性粒细胞浸入组织的产物，其变化能够反映炎症的严重程度，MPO含量越高表明炎症损伤越强[34]。目前，通过检测MPO含量判断组织中炎性浸润程度已经成为世界公认的标准[35]。在本试验中，M组以及各药物处理组乳腺中MPO含量均极显著高于BC组，表明各组乳腺中均有炎性浸润情况发生；但与M组相比，ZY各剂量组以及Dex组的MPO含量均极显著降低，提示各药物处理组小鼠乳腺组织中炎性浸润程度均得到有效缓解，与Yu等[33]的研究结果趋势一致。本试验通过检测小鼠乳腺中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PPAR-γ以及MPO的含量探讨ZY对乳腺炎小鼠模型中乳腺组织炎性因子及氧化产物的调节作用，虽然ZY各剂量组以及Dex组小鼠的乳腺细胞因子并未恢复到与BC组相当的水平；但与M组小鼠相比，ZY各剂量组的小鼠乳腺中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MPO含量极显著降低，PPAR-γ含量极显著升高。综上所述，ZY可缓解LPS诱导的小鼠乳腺炎，且其缓解机制可能与恢复乳腺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PPAR-γ、MPO含量有关，但本试验并未对ZY调节LPS诱导的小鼠乳腺炎的具体作用机制展开进一步研究，因此本课题组下一步将从机制角度进行深入研究。4结论本试验通过乳腺内注射LPS构建小鼠乳腺炎模型，并探讨ZY对乳腺炎的调节作用。试验结果表明，高、中、低剂量的中草药提取物均可缓解LPS导致的小鼠乳腺组织的损伤；在造模后连续7 d灌胃不同剂量的中草药提取物可极显著降低小鼠乳腺组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO含量且以ZY-H组效果最好，但其主要的作用机制还有待进一步研究。综上所述，中草药提取物对LPS诱导的小鼠乳腺炎具有正向调节作用。